ID 7946
Lehmann, Christian: Charakterisierung des Bakterienisolates C1 aus Cystodytes
dellechiajei
Hamburg: Diplomica GmbH, 2004
Zugl.: Universität Regensburg, Universität, Diplomarbeit, 2004
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Diplomica GmbH
http://www.diplom.de, Hamburg 2004
Printed in Germany
I
NHALTSVERZEICHNIS
I
I
NHALTSVERZEICHNIS
I. E
INLEITUNG
... 1
Auf der Suche nach Naturstoffen ... 1
Die Ozeane eine blaue Schatzkammer?... 4
Marine Biotechnologie Probleme, Ausblicke und Hoffnungen... 8
Charakterisierung des Bakterienisolates C1 ... 10
II. M
ATERIAL UND
M
ETHODEN
... 11
1.
Bezugsquellen... 11
1.1
Chemikalien... 11
1.2 Enzyme und Reaktionskits ... 13
1.3
Geräte... 14
1.4 Verbrauchsmaterial und Sonstiges... 15
2.
Organismen ... 16
3. Nährmedien und Kulturbedingungen... 17
3.1
Kulturbedingungen ... 17
3.2 Zusammensetzung der Medien ... 17
3.2.1 Allgemeine Lösungen... 17
3.2.2 Marine Broth 2216 (MB) ... 18
3.2.3 Minimalmedien für C1 ... 19
3.2.4 Polymermedien für C1 ... 20
3.2.5 Medien mit verschiedenen Kohlenstoff-Zusätzen... 20
3.2.6
M88-4d/5-Kulturmedium ... 21
3.2.7
Luria-Bertani
(LB)-Medium ... 21
3.2.8 Biolog Universal Growth (BUG)-Agar ... 21
3.2.9
Todd-Hewitt-Broth ... 22
3.2.10
M9-Medium ... 22
3.3 Herstellung der Medien ... 23
4. Gewinnung von Reinkulturen ... 23
4.1
Ausstrichverfahren ... 23
4.2
Verdünnungsreihen... 24
4.3 Zellvereinzelung mit der Laserpinzette ... 24
5. Herstellung von Dauerkulturen ... 25
5.1
Glycerinkulturen... 25
5.2
Roti-Store-Kryokulturen ... 25
5.3 Lagerung über Flüssigstickstoff... 25
6.
Sterilisation ... 26
7.
Mikroskopie ... 26
7.1
Phasenkontrastmikroskopie... 26
7.2
Fluoreszenzmikroskopie... 26
7.3
Rasterelektronenmikroskopie ... 27
8.
Wachstumsbestimmung... 28
I
NHALTSVERZEICHNIS
II
8.1
Thoma-Zählkammer... 28
8.2 Optische Dichte ... 28
8.3
Lebendkeimzahlbestimmung... 29
9.
DNA-Isolierung ... 29
9.1 Isolierung von Gesamt-DNA ... 29
9.2 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli ... 30
9.3
Gelelektrophorese ... 30
10. Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)... 32
10.1
Standard-PCR-Ansatz ... 32
10.2 16S rDNA-Amplifikation... 32
10.3
gyrB-Teilamplifikation ... 33
10.4 Reinigung von PCR-Produkten ... 34
11. Klonierung von PCR-Produkten ... 34
11.1
Ligation... 35
11.2
Elektroporation ... 35
11.3
Blau-Weiss-Screening ... 35
11.4 Restriktionsverdau und Gelelektrophorese ... 36
12. Phylogenetische Analyse von C1 ... 36
12.1 Sequenzierung von 16S rDNA und gyrB ... 36
12.2 Online-Alignment mit FASTA3 ... 38
12.3 Stammbaumerstellung mit ARB... 38
13.
Stoffwechselphysiologische
Untersuchungen ... 39
13.1 Verwertung verschiedener Polymerstoffe ... 39
13.2 Verwertung verschiedener Kohlenstoff-Quellen ... 39
13.2.1
Mikrotiterplatten (BIOLOG-System) ... 39
13.2.2
Flüssigkultur-Ansätze... 40
13.3 Sensitivität gegenüber Antibiotika... 40
13.4
Katalasenachweis... 41
13.5
Gram-Färbung ... 41
14. Produktion biologisch aktiver Substanzen... 42
14.1 Gewinnung des Überstandes stationärer C1-Kulturen... 42
14.2 Antibiotische Aktivität im C1-Überstand... 42
14.2.1
Schicht-Methode... 42
14.2.2
Plättchen-Methode ... 43
14.2.3
Stanz-Methode... 43
14.3 Bildung von Autoinduktoren... 43
15. Verarbeitung von Cystodytes dellechiajei-Lebendproben... 44
15.1 Gewinnung von Mazeraten und Überständen... 44
15.2 Herstellung von Kryoschnitten... 44
15.3
Konservierung ... 45
16. Färbungen mit Fluoreszenzfarbstoffen ... 45
16.1
DAPI-Färbungen... 45
16.2 Lebend-Tot-Färbungen mit BacLightTM... 46
I
NHALTSVERZEICHNIS
III
16.3 Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung (FISH) ... 46
16.3.1
Vorbereitung der Objektträger ... 46
16.3.2 Puffer und Lösungen ... 47
16.3.3
Fluoreszenzmarkierte Oligonukleotide... 49
16.3.4 Bestimmung der Hybridisierungsbedingungen ... 50
16.3.5 Fixierung der Zellen... 51
16.3.6
Hybridisierung ... 51
17. Computerprogramme, Textverarbeitung und Internetresourcen ... 52
III. E
RGEBNISSE
... 54
1. Das Isolat C1 aus Cystodytes dellechiajei (Della Valle, 1877)... 54
2. Untersuchungen zur Morphologie ... 56
2.1
Zellmorphologie... 56
2.1.1
Phasenkontrastmikroskopie ... 56
2.1.2
Rasterelektronenmikroskopie... 58
2.2
Koloniemorphologie... 59
3. Entwicklung eines Minimalmediums... 61
4. Stoffwechselphysiologische Untersuchungen ... 63
4.1 Polymerverwertung und Nachweis von Exoenzymen ... 63
4.2
Kohlenstoff-Verwertung ... 64
4.2.1
BIOLOG-Mikrotiterplatten ... 64
4.2.2
Flüssigkultur-Ansätze... 66
4.3 Sensitivität gegenüber Antibiotika... 66
4.4
Katalasetest ... 67
4.5
Gram-Färbung ... 67
5. Produktion biologisch aktiver Substanzen... 67
5.1 Antibiotische Wirksamkeit des Überstandes... 67
5.2 Bildung von Autoinduktoren... 68
6. Phylogenetische Analyse ... 70
6.1 16S rDNA-Analyse ... 70
6.2
gyrB-Analyse ... 71
7. Phylogenetic Staining... 73
7.1 Staining von Reinkulturen... 73
7.2 Staining von Mischkulturen ... 74
7.3 Staining von Mazeraten ... 76
7.4 Staining von Isolaten aus C. dellechiajei... 77
7.5 Staining von Kryoschnitten ... 78
8. Weitere qualitative und quantitative Untersuchungen ... 80
8.1 C1-Nachweis außerhalb C. dellechiajei... 80
8.2
,,C1-Dominanz"... 80
8.3 16S rDNA-Sequenzierung eines Isolates aus C. dellechiajei... 81
I
NHALTSVERZEICHNIS
IV
IV. D
ISKUSSION
... 83
1.
Morphologie ... 83
2.
Stoffwechsel ... 85
3. Biologisch aktive Substanzen ... 87
4. Phylogenetische Analyse ... 88
4.1 16S rDNA-Sequenzvergleich... 88
4.2
gyrB-Sequenzvergleich ... 90
5. C1 und C. dellechiajei... 91
6. Vorschlag zur Beschreibung einer neuen Art... 95
V. Z
USAMMENFASSUNG
... 96
VI. A
BKÜRZUNGSVERZEICHNIS
... 97
VII. L
ITERATURVERZEICHNIS
... 100
VIII. A
NHANG
... 108
Sequenz der 16S rDNA des Isolates C1 ... 108
gyrB-Teilsequenz des Isolates C1 ... 109
Alternativer Stammbaum: Neighbor-Joining mit Bacterial Filter ... 110
Alternativer Stammbaum: Maximum-Parsimony ohne Filter... 111
16S rRNA-Sekundärstruktur von E. coli... 112
A
BBILDUNGSVERZEICHNIS
V
A
BBILDUNGSVERZEICHNIS
III/1: Beschaffung der Tierproben... 54
III/2: Cystodytes dellechiajei... 55
III/3: verschiedene Wachstumsphasen von C1... 57
III/4: Lebend-Tot-Färbung mit
BacLightTM... 58
III/5: REM: C1 exponentielles Wachstum... 58
III/6: REM: C1 stationäre Phase ... 59
III/7: unterschiedliche Koloniemorphologien von C1 ... 60
III/8: Wachstumskurven... 62
III/9: C-Verwertung auf BIOLOG-Mikrotiterplatten ... 65
III/10: Überstandhemmtest... 68
III/11: Bildung von Autoinduktoren ... 69
III/12: Phylogenet. Stammbaum: Neighbor Joining o. Filter ... 71
III/13: FISH: C1-Reinkultur... 74
III/14: FISH: C1-E. coli-Mischkultur... 75
III/15: FISH: C1-CJ11049-Mischkultur... 75
III/16: FISH: C. dellechiajei-Mazerat... 76
III/17: FISH: Isolat MW3 aus Meerwasser ... 78
III/18: FISH+DAPI: Kryoschnitte v. C. dellechiajei... 79
III/19: C1 16S rDNA-Sequenzvariationen... 82
VIII: Phylogenet. Stammbaum: Neighbor Joining mit Bac. Filter ... 110
VIII: Phylogenet. Stammbaum: Max. Parsimony ohne Filter ... 111
VIII: 16S rRNA-Sekundärstruktur von E. coli... 112
I. E
INLEITUNG
1
I. E
INLEITUNG
Auf der Suche nach Naturstoffen
Schon immer hat sich der Mensch auf die Natur verlassen, um seine Bedürfnisse in
Sachen Nahrung, Transport, Unterkunft, Kleidung und nicht zuletzt Arzneien zu
befriedigen und dadurch sein Leid bei Erkrankungen und Verletzungen mit natür-
lichen Heilmitteln zu lindern. Tausende Jahre wurde das Wissen über die Heilkraft
bestimmter Pflanzen oder Mineralien überliefert und durch Beobachten und Experi-
mentieren ausgeweitet. Diese Erkenntnisse stellten allerdings nur ein Erfahrungsgut
dar, ohne jemals kritisch überprüft zu werden. Viel später erst wurde versucht, auch
den theoretischen Hintergrund einer Arzneimitteltherapie zu bedenken und somit
gezielt nach Wirkstoffen zu suchen die Pharmakologie war geboren. So forderte
Theoprastus Bombastus von Hohenheim, genannt Paracelsus (1493-1541 n. Chr.), als
erster die Kenntnis der aktiven Substanz in einem verordneten Mittel und wehrte
sich damit gegen die unsinnigen, ja tödlichen Stoffgemische mittelalterlicher
Medizin, die auf den antiken Lehren von Hippokrates (460-370 v. Chr.) und Galen
(129-200 n. Chr.) beruhten (Lüllmann & Mohr, 1990).
Die Arbeiten von Louis Pasteur (1822-1895; siehe Krasner, 1995) und Robert Koch
(1843-1910) forcierten die Bemühungen auf der Suche nach antimikrobiellen Sub-
stanzen und führten schließlich zur Entwicklung des ersten wirksamen Chemo-
therapeutikums durch Paul Ehrlich (1854-1915). Das Präparat ,,606" (,,Salvarsan",
Dioxydiamidoarsenobenzol) verschaffte ab 1907 tausenden mit Treponema pallidum
infizierten Menschen Linderung, wenn auch nicht ohne Nebenwirkungen. Neben
Syphillis konnte fortan auch das von Rickettsien verursachte Rückfallfieber kuriert
werden (Quelle: http://www.m-ww.de).
I. E
INLEITUNG
2
Diese Behandlungsmethode wurde erst in den Jahren nach 1940 verdrängt, als der
schottische Mediziner und Bakteriologe Alexander Fleming (1881-1955) durch Zufall
1928 eine der bedeutendsten Entdeckungen der modernen Wirkstoffforschung
machte: als erster hatte er die antibiotische Effektivität eines Schimmelpilzes gegen-
über Mikroorgansimen beobachtet. Eine Verunreinigung in seinen Zuchtschalen
ein Pilz der Gattung Penicillium hemmte das Wachstum von Staphylokokken. Nach
dieser Entdeckung war klar, dass die Zukunft der Suche nach Wirkstoffen in der
Natur selbst lag. Zum ersten Mal in der Geschichte fahndete man jetzt systematisch
nach Naturstoffen, die als Bakterizide, Insektizide, Fungizide und Herbizide Nutzen
fanden. Anfänglich handelte es sich dabei vor allem um antibiotisch wirksame Stoffe,
die hauptsächlich aus Boden-Mikroorganismen isoliert wurden, wie etwa Amino-
glycoside, Rifamycine, Polyene, Tetracycline und Makrolide aus Streptomyceten und
Proteine bzw. Peptide aus verschiedenen Bacillus-Arten.
Jedoch meist schon kurz nach Einführung eines neuen Antibiotikums traten
Resistenzen auf (z. B. Glazer & Nikaido, 1995). Um diesem Verlauf entgegenzu-
wirken, musste man neue, bisher unbekannte Wirkstoffe gewinnen, was zeitweise
gelang (Gibbons, 1992). Völlig neue Leitstrukturen sind freilich seit über 20 Jahren
nicht mehr gefunden worden (Wirth, pers. Mitteilung) und mehr als 90 % aller ,,neu"
entdeckten aktiven Kulturen produzieren schon bekannte Substanzen (Fenical, 1993).
Durch die Entwicklung halbsynthetischer Derivate unwirksam gewordener Anti-
biotika blieben viele multiresistente Keime unter Kontrolle. Momentan jedoch stellen
uns Erreger nosokomialer Infektionen vor immer größere Probleme. Vollresistente
Staphylococcus aureus- und Enterococcus faecalis-Stämme können selbst mit Vanco-
mycin, einem der letzten, bis vor kurzem noch effektiven Medikamente, nicht mehr
behandelt werden (Gottlieb, 2003 bzw. Ben et al., 1996). Hoffnung gibt hier das so-
genannte Ascochital, ein Antibiotikum aus dem marinen Ascomycet Kirschsteinothelia
maritima (Kusnick et al., 2002), gegen das bislang noch keine resistenten Staphylo-
kokken-Stämme aufgetreten sind (Dorn, 2003; siehe auch Sonderausgabe Trends in
Microbiology, 1994, 2(10):341-425: Drug resistance: the new apocalypse).
I. E
INLEITUNG
3
Vielversprechend scheint auch eine kürzlich beschriebene, neue antimikrobielle
Stoffklasse zu sein. Dabei handelt es sich um ein Quinolonderivat, das Pathogene wie
Haemophilus influenzae, Moraxiella catarrhalis und Streptococcus pneumoniae ohne
toxische Nebeneffekte auf menschliche Körperzellen zuverlässig abtötet (Dandliker
et al., 2003).
Dieses Beispiel macht deutlich, wie wichtig die Suche nach völlig neuen Substanzen
und Wirkmechanismen ist und auch zukünftig bleiben wird, denn Antibiotika-
resistenzen werden, nicht zuletzt wegen unsachgemäßer Anwendung, auch weiter-
hin um sich greifen. So hält Dr. D. Pirages, Direktor des Harrison Centers an der
Universität Maryland, Infektionskrankheiten gar für ,,die potentiell größte Bedro-
hung der Menschheit in der Zeit nach dem Kalten Krieg" (Pirages, 1995).
Eine schier endlos sprudelnde Quelle neuer, unbekannter Moleküle stellt die belebte
Natur dar, weithinausgehend über die heutigen Möglichkeiten der chemischen
Synthese. Die Produzenten stammen aus allen Domänen Bacteria, Archaea und
Eukarya, hier wiederum Einzeller, Pflanzen, Pilze und Tiere. Im Jahr 1997 beruhten
bereits 60 % der Wirkstoffe sämtlicher zugelassener Medikamente auf dem Gebiet
der Krebs- und Infektionskrankheiten auf Naturprodukten und 1991 waren fast die
Hälfte der meistverkauften Pharamazeutika Naturstoffe oder deren Abkömmlinge
(Cragg et al., 1997). Berühmte Beispiele für solche natürlich vorkommenden und in-
zwischen vollsynthetisch hergestellten Substanzen, sind das bekannteste Schmerz-
mittel der Welt, die Acetylsalicylsäure (,,Aspirin") aus der Weidenrinde, oder Taxol®
aus der Rinde der pazifischen Eibe Taxus brevifolia (Wani et al., 1971). Dieses wird
mittlerweile unter dem Handelsnamen Paditaxel zur Behandlung von Eierstockkrebs
und metastasierendem Brustkrebs eingesetzt.
Das Wirkspektrum der Naturstoffe geht natürlich weit über die beschriebenen An-
wendungen hinaus. Zum Einsatz kommen sie nicht nur im Bereich der Biomedizin,
sondern auch in der Landwirtschaft, Kosmetik und Industrie. So wird z. B. das BT-
Toxin von Bacillus thuringiensis als Insektizid eingesetzt, Pseudopterosin C aus der
Weichkoralle Pseudopterogorgia elisabethae findet in Hautcremes Verwendung
I. E
INLEITUNG
4
(Colwell, 2002; Fenical 1997) und thermostabile Enzyme von z. B. Thermotoga
maritima, wie die UltmaTM DNA-Polymerase, sind kommerziell erhältlich (Huber &
Stetter, 2000).
Die Ozeane eine blaue Schatzkammer?
Während bisher erst 5-15 % aller etwa 250000 beschriebener Arten höherer Pflanzen
systematisch auf die Produktion bioaktiver Substanzen überprüft wurden, ist das
Potential mariner Lebewesen noch weitaus weniger untersucht (Cragg et al., 1997).
Man nimmt an, dass in den Ozeanen, die ca. 70 % der Erdoberfläche bedecken, etwa
500 Millionen verschiedene Arten von Pflanzen, Tieren und vor allem Mikro-
organismen leben (Dorn, 2003). Mehr noch: von 27 verzeichneten Phyla kommen nur
17 auf dem Land vor, alle 27 hingegen im Meer (Rayl, 1999). Zudem sind bis heute
nur etwa 5000 Arten prokaryotischer Lebensformen (terrestrische und marine) be-
schrieben worden, Schätzungen gehen aber von weit mehr als einer Million Arten
aus (Schleifer & Horn, 2000). Dies bedeutet, dass weniger als 0,5 % der insgesamt
existierenden Prokaryoten bekannt, geschweige denn kultivierbar sind. Die systema-
tische Erforschung der mikrobiellen Vielfalt und der Biodiversität generell in den
Weltmeeren steckt also gerade erst in den Kinderschuhen. Dementsprechend stam-
men bis jetzt nur etwa 10 % aller bekannten Naturstoffe aus marinen Organismen,
Tendenz jedoch steigend (Dorn, 2003).
W. Fenical geht allerdings davon aus, dass innerhalb der nächsten 20 Jahre sämtliche
marinen Makroorganismen analysiert und auf Produktion aktiver Substanzen getes-
tet sein werden. Die Entdeckung neuer Wirkstoffe wird sich zukünftig mehr auf die
Erforschung der mikrobiellen Welt konzentrieren (Fenical, 1997). Die Meere stellen
also die größte natürliche Resource für neue Verbindungen dar und man fängt
gerade erst an, dieses Potential für die Menschheit nutzbar zu machen (Hentschel,
2000).
I. E
INLEITUNG
5
Schon in den 1950er Jahren, konnten einige wenige marine Wirkstoffe isoliert
werden. Dazu zählen Acyclovir (Zovirax®), das antivirale Wirkung zeigte und
womit noch heute Herpes bekämpft wird, sowie Cytarabine (Cytosar®), das bei der
Behandlung bestimmter Krebserkrankungen Verwendung findet (Rayl, 1999). Beide
Stoffe wurden aus dem karibischen Zitronenschwamm Cryptothetya crypta extrahiert.
Darüberhinaus entdeckte man in dem Pilz Cephalosporium acremonium vor der Küste
Sardiniens die Cephalosporine, eine Gruppe damals neuer Antibiotika (Quelle:
http://focus.msn.de).
Vor diesem Hintergrund begann man gegen Ende der 70er Jahre des 20. Jahr-
hunderts, intensiv in den Weltmeeren nach neuen chemischen Verbindungen zu
suchen. Viele bioaktive Substanzen konnten seither isoliert werden. Als Produzenten
ließen sich Bakterien (auch Cyanobakterien), Pilze, bestimmte Algen, Schwämme,
Seehasen, Nudibranchia, Weichkorallen , Bryozoen, Mollusken, Echinodermen und
Tunikaten nachweisen (Faulkner, 2000). Für einige dieser vielversprechenden Meta-
bolite ist allerdings eine Anwendung am Menschen aufgrund starker Neben-
wirkungen ausgeschlossen. So musste das Antitumormittel Didemnin B (DB) aus
dem Tunikaten Trididemnum solidum wegen kardiotoxischer Eigenschaften nach der
klinischen Phase II aus dem Programm genommen werden; Testphasen mit dem
chemisch nah verwandten Dehydrodidemnin B aus Aplidium albicans dauern hin-
gegen noch an (Rinehart, 2000). Im fortgeschrittenen Stadium der Klinischen Phase II
befindet sich zur Zeit Ecteinascidin-743 (ET-743), ein Alkaloid aus der tropischen
Seescheide Ecteinascidia turbinata. Es wird hochwirksam gegen ansonsten therapie-
resistente Weichteil-Sarkome angewendet (Cvetkovic et al., 2002).
Wie und warum bilden Meeresbewohner überhaupt solche komplizierten Struk-
turen? Oft handelt es sich dabei um chemische Waffen sessiler Organismen
(Faulkner, 2000). Schwämme beispielsweise leben meist festsitzend auf Felsen oder
am Meeresboden und können sich weder aktiv verteidigen noch fliehen. Mit Hilfe
bioaktiver Substanzen schützen sie sich gegen Fressfeinde oder hindern Algen und
Bakterien daran, sie zu überwachsen (Thakur et al., 2000; Haygood et al., 1999).
I. E
INLEITUNG
6
Nähere Untersuchungen zeigten, dass für die Produktion vieler aktiver Substanzen
mit den Makroorganismen vergesellschaftete Mikroben verantwortlich sind (Thakur
et al., 2003; Jensen & Fenical, 1996; Kobayashi & Ishibashi, 1993). Betrachtet man etwa
Schwämme der Gattung Verongia oder Aplysina, ist dies nicht weiter verwunderlich,
da die mikrobielle Besiedelung in deren Gewebe 40 % ihres Gesamtgewichtes aus-
macht (Hentschel et al., 2001 und 2002). Auch in der für diese Arbeit herangezogenen
Ascidie Cystodytes dellechiajei wurde von etwa 2-3 mm langen, schlanken Stäbchen
berichtet, die unterhalb der Cuticula in großer Menge vorkommen (Rottmayer et al.,
2001).
Eine solche Symbiose macht für beide beteiligten Arten Sinn: sessile Lebewesen
können sich durch die von Mikoorganismen produzierten sekundären Metabolite
diverser Feinde erwehren, während die Mikroben im Gewebe günstigere Lebens-
umstände vorfinden. Weiterhin sind auch Bereitstellung von Nährstoffen, Stabili-
sierung des (Schwamm)skeletts und der Abbau toxischer Stoffwechselprodukte als
Funktionen mikrobieller Symbionten beschrieben worden (Hentschel et al., 2002 und
dort angegebene Literaturhinweise).
Solche Wechselbeziehungen sind vermutlich schon vor sehr langer Zeit entstanden.
Die Ursprünge der Klasse der Porifera etwa, gehen bis in das Präkambrium vor 600
Millionen Jahren zurück. Ein Vergleich der mikrobiellen Lebensgemeinschaften
innerhalb zweier Schwämme, Aplysina aerophoba und Theonella swinhoei deckte auf,
dass es sich dabei um eine mehr oder weniger einheitliche Population handelt, die
phylogentisch weit entfernt von anderen im Meerwasser oder Sediment lebenden
Bakterien ist. Möglich wäre, dass es sich um eine entwicklungsgeschichtlich sehr alte
Gemeinschaft handelt, das Ergebnis einer koevolutionären Schöpfung, wobei Mikro-
organismen nach und nach symbiontisch in den Schwamm integriert wurden. Die
Entstehung eines derartig einheitlichen Musters in mikrobiellen Lebensgemein-
schaften zweier Organismen, die ansonsten keine Gemeinsamkeiten aufweisen, setzt
das Vorhandensein hochspezifischer Selektionsmechanismen voraus. Ein Beispiel
hierfür wäre die Widerstandsfähigkeit der Bakterien gegenüber Phagocytose durch
I. E
INLEITUNG
7
Archeozyten des Schwammes. Dieser Selektionsdruck könnte im Laufe der Zeit bio-
aktive Substanzen produzierende Organismen hervorgebracht haben (Hentschel et
al., 2002).
Etwa 11 % der aus A. aerophoba isolierten Bakterien zeigten antimikrobielle Aktivität
gegen klinisch relevante, multiresistente Pathogene. Bei diesen Produzenten handelte
es sich um Mitglieder der Gattungen Bacillus, Enterococcus, Arthrobacter, Micrococcus,
Vibrio und Pseudoalteromonas, sowie um Vertreter der -Proteobacteria und Gram-
positiver, Nieder-GC Keime (Hentschel et al., 2001). Für die mutualistisch lebenden
Idiomarina spec., Pseudomonas spec. (Thakur et al., 2003), Micrococcus spec., Vibrio spec.,
Alteromonas spec. und Streptomyces spec. (Kobayashi & Ishibashi, 1993; Fenical, 1993),
sowie für das Isolat M88-4d/5 aus Alcyonium digitatum (Ruhland, 2001) wurde eben-
falls von der Produktion biologisch aktiver Metabolite berichtet. Diese Liste ließe sich
noch weiter fortsetzen.
Es bleibt festzuhalten, dass die Produktion biologisch aktiver Substanzen bei vielen
symbiontisch lebenden Mikroorgansimen beobachtet werden kann, die aus phylo-
genetisch völlig unterschiedlichen Divisionen stammen. Ihre Wirkstoffe können
komplett neue Leitstrukturen, aber auch schon bekannte Verbindungen oder
Derivate hiervon darstellen. Angesichts des derzeitigen Wissensstandes darf man auf
weitere Entdeckungen und Fortschritte auf dem Gebiet der Naturstoffforschung
hoffen.
I. E
INLEITUNG
8
Marine Biotechnologie Probleme, Ausblicke und Hoffnungen
In den letzten 30 Jahren haben die biologischen Wissenschaften auf vielen Gebieten
enorme Fortschritte gemacht. Die marine Biotechnologie wurde trotz glänzender
Entdeckungen jedoch stark vernachlässigt (Colwell, 2002).
Dafür gibt es eine Reihe von Gründen. Allein die Entdeckung einer neuen
chemischen Verbindung ist nicht genug. Für eingehendere Untersuchungen muss
der eigentliche Produzent identifiziert und im Idealfall kultiviert werden. Man
schätzt, dass momentan weniger als 1 % aller marinen Mikroorganismen im Labor
gezüchtet werden können (siehe z. B. Hentschel et al., 2000). Auch verlieren aus
marinen Makroorganismen isolierte und in Reinkultur gebrachte Bakterien gele-
entlich durch veränderte Umweltbedingungen, etwa durch ein abgeändertes Nähr-
stoffangebot oder durch Wegfall jeglichen Selektionsdrucks, ihre Fähigkeit wirksame
Substanzen zu produzieren (Hentschel et al., 2001).
Erschwerend kommt hinzu, dass viele Produzenten oft nur sehr selten vorkommen
und/oder die marinen Wirkstoffe nur in geringsten Mengen gebildet werden. Als
Beispiel hierfür sei der japanische Schwamm Halichondria okadai genannt. Er erzeugt
ein makrozyklisches Lacton, das Halichondrin B (Hirata & Uemura, 1986), welches
Melanom- , Leukämie- und Eierstockkrebszellen zuverlässig abtötet. Aus einer
Tonne Schwammgewebe lassen sich allerdings nur 20 mg dieses Wirkstoffes ge-
winnen (Dorn, 2003).
Um diesem Dilemma zu entkommen, werden mehrere Strategien verfolgt. Dabei
muss vor allem schonend und nachhaltig gehandelt werden, um die Resourcen zu
schützen. Bemühungen, marine Invertebraten im Labor in der sogenannten Mari-
kultur zu züchten, werden intensiviert. Des Weiteren wird versucht, Zellkulturen
von Makroorganismen anzulegen, was für Schwämme in einigen Fällen bereits ge-
glückt ist (Müller, W.E.G., Mainz; in: Dorn, 2003). In diesem Zusammenhang sind
gleichfalls die Methoden der Gentechnologie und Fermentation sehr wichtig. Gelingt
es, das (die) für die aktive Substanz codierende(n) Gen(e) zu klonieren, kann es in
I. E
INLEITUNG
9
einen leichter kultivierbaren Organismus, wie etwa E. coli, transferiert und im Ideal-
fall auch exprimiert werden. Dass dies prinzipiell möglich ist, zeigt die Klonierung
des für das green-fluorescent-protein (Gfp) codierenden Gens aus der Qualle
Aequoria spec. bzw. der Koralle Renilla reniformis (Colwell, 2002). Gfp findet vor allem
in der Zell-, Entwicklungs- und Molekularbiologie als Fusionsprotein Anwendung
(siehe z. B. Yang et al., 1996).
Darüberhinaus wird versucht, neu entdeckte Verbindungen mit Methoden der
organischen Chemie nachzubauen und zu derivatisieren. Bei dieser ,,Optimierung
einer Leitstruktur" wird in mehreren Richtungen gleichzeitig gearbeitet: Verschie-
dene Synthesemethoden werden parallel getestet und miteinander kombiniert. Am
Ende stehen im Idealfall vereinfachte, aber biologisch aktive Moleküle, wie die
Arbeit an Bryostatinen und Ecteinascidinen zeigen konnte (Newman et al., 2000).
Ribosomale RNA (rRNA)-Screening-Techniken, wie Fluoreszenz-In-Situ-Hybridi-
sierung (FISH), erlauben eine schnelle Identifizierung und grobe phylogenetische
Einordnung relevanter Mikroorganismen. In Kombination mit der Confocal Laser
Scanning Mikroskopie (CLSM) lässt sich auch die räumliche Anordnung mikrobieller
Lebensgemeinschaften in ihrer natürlichen Umgebung rekonstruieren (Wagner et al.,
2003). Viele Probleme bei der Anwendung von FISH können mittlerweile durch
Einsatz verschiedener Techniken behoben werden. So ist man beispielsweise im-
stande, eine schlecht erreichbare Targetsequenz durch zusätzliche Zugabe un-
markierter ,,Helfer-Sonden" oder Peptidnukleinsäuren mit dem entsprechenden
Oligonukleotid zu hybridisieren. Zellen mit niedrigem Ribosomengehalt können oft
mittels der sogenannten CARD (catalysed reporter deposition)-FISH detektiert
werden (Wagner et al., 2003).
Abschließend bleibt festzuhalten, dass angesichts der Erfolge und Entdeckungen der
letzten 20 Jahre auf dem Gebiet der marinen Naturstoffforschung gezeigt werden
konnte, welches Potential marine Biotechnologie in sich birgt. Auf die Entwicklung
völlig neuer Behandlungsmethoden für verschiedenste Krankheiten darf gehofft
werden. Anstrengungen, Biodiversität in den Weltmeeren zu erhalten, müssen
I. E
INLEITUNG
10
weiterhin verstärkt werden, um diese einmaligen Resourcen auch künftig nutzen zu
können.
Charakterisierung des Bakterienisolates C1 aus Cystodytes dellechiajei
In dieser Arbeit sollte das Isolat C1, das aus der koloniebildenden Ascidie C.
dellechiajei gewonnen wurde, näher untersucht werden.
Hierzu wurden Daten zur Morphologie, Phylogenie und über stoffwechsel-
physiologische Fähigkeiten erhoben. Versuche zur Natur der biologisch aktiven
Substanz wurden durchgeführt. Eine Stamm-spezifische Sonde sollte entwickelt
werden, um C1 in den im Labor gehälterten Tieren direkt nachweisen zu können.
II. M
ATERIAL UND
M
ETHODEN
11
II. M
ATERIAL UND
M
ETHODEN
1. Bezugsquellen
1.1 Chemikalien
Substanz Bezugsquelle
Acrylamid Serva,
Heidelberg
Agar
Difco, Sparks, MD (USA)
Agarose Sigma,
Deisenhofen
Alginat Peqlab,
Erlangen
AMP Roche,
Mannheim
AMPER Serva,
Heidelberg
Antibiotika, verschiedene
Oxoid, Wesel
BacLightTM
Molecular Probes, Leiden (NL)
Bromphenolblau Serva,
Heidelberg
BSA Sigma,
Deisenhofen
Casaminosäuren
Difco, Detroit, MI (USA)
Cellulose Roth,
Karlsruhe
Chill-out 14 Liquid Wax
MJ-Research Inc., Waltham, MA (USA)
Chitin Sigma,
Deisenhofen
Chitosan ICN,
Eschwege
Chrom-(III)kaliumsulfat Sigma,
Deisenhofen
Citifluor AF-1
Citifluor Products, Canterbury (UK)
CMP Roche,
Mannheim
Coomassie Brilliant Blue G250
Serva, Heidelberg
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindol) Sigma,
Deisenhofen
II. M
ATERIAL UND
M
ETHODEN
12
Diatomeenerde/Celite Sigma,
Deisenhofen
DMSO Serva,
Heidelberg
EDTA ICN,
Eschwege
Ethanol (absolut)
Baker, Deventer (NL)
Ethidiumbromid Serva,
Heidelberg
Glutaraldehyd (25 % [v/v], EM Grade)
Agar Scientific, Essex (UK)
Glycerin ICN,
Eschwege
Glycogen Sigma,
Deisenhofen
GMP Roche,
Mannheim
Guanidinthiocyanat Roth,
Karlsruhe
Gummi (Galactomannanpolysaccharid)
Sigma, Deisenhofen
Hefeextrakt
Difco Laboratories, Detroit, MI (USA)
IPTG Serva,
Heidelberg
Pepton ICN,
Eschwege
SDS (Natriumdodecylsulfat)
ICN, Eschwege
Serdolit MB-1 (20-25 mesh)
Serva, Heidelberg
Succinat Sigma,
Deisenhofen
TEMED Serva,
Heidelberg
Thymidin Sigma,
Deisenhofen
Tissue-Tek®
Sakura, Zoeterwoude (NL)
TMP Roche,
Mannheim
Trehalose Sigma,
Deisenhofen
Tris Amersham,
Braunschweig
Tween 80
Serva, Heidelberg
X-Gal ICN,
Eschwege
Xylan Sigma,
Deisenhofen
Sonstige hier nicht aufgeführte Chemikalien wurden von der Firma VWR, Darm-
stadt, bezogen.
II. M
ATERIAL UND
M
ETHODEN
13
1.2 Enzyme und Reaktionskits
Enzyme Bezugsquelle
Lysozym
Sigma, Deisenhofen
BsaA I
Schnittstelle 5`...PyAC/GTPu...3`
3`...PuTG/CAPy...5`
New England Biolabs (NEB), Frankfurt
BstE II
Schnittstelle 5`...G/GTNACC...3`
3`...CCANTG/G...5`
New England Biolabs (NEB), Frankfurt
EcoR I
Schnittstelle 5`...G/AATTC...3`
3`...CTTAA/G...5`
New England Biolabs (NEB), Frankfurt
Hinc II
Schnittstelle 5`...GTPy/PuAC...3`
3`...CAPu/PyTG...5`
New England Biolabs (NEB), Frankfurt
Reaktionskit Bezugsquelle
E. Z. N. A. Plasmid Miniprep Kit I
Peqlab, Erlangen
pGem-T Vectorsystem I
Promega, Mannheim
QIAquick PCR Purification Kit (50)
Qiagen, Hilden
Taq PCR Master Mix Kit
Qiagen, Hilden
II. M
ATERIAL UND
M
ETHODEN
14
1.3 Geräte
Gerät Hersteller
Blockthermostat Thermomixer compact
5350
Eppendorf, Hamburg
Digitalkameras
Nikon Coolpix 950
Nikon Coolpix 990
Nikon, Düsseldorf
Nikon, Düsseldorf
Inkubatoren
Heraeus Typ UT6120 und Typ B12
Mytron WB 120
MWG Biotech Mini Oven
Heraeus, Hanau
Mytron, Heiligenstadt
MWG, Ebersberg
Mikroskope
Labophot-2
Olympus BX60 mit UV-Netzgerät
U-RFL-T
Nikon, Düsseldorf
Olympus, Hamburg
Mikrotom CM3000
Leica, Bensheim
Photometer Spectronic Genesys 5
Milton Roy, Rochester, NY (USA)
Rollenmischer/Cellmixer CMV
(,,Rollerdrum")
Osrath, Geretsried
Vortex Genie 2
Scientific Industries, Bohemia, NY
(USA)
Waage Precision Standard TP400D
Ohaus, Cambridge (UK)
Wasserbadschüttler Gyrotory Model G76
New Bruinswick Scientific, New
Bruinswick, NJ (USA)
Zentrifugen
Biofuge 13 mit Rotor #3757
Sorvall® RC5C Plus mit Rotoren
SS34, GSA und GS3
Vakuumzentrifuge DNA-Mini
Labofuge GL mit Rotor #2150
Heraeus, Hanau
Du Pont, Newton, CT (USA)
Heto-Holten, Alleroed (DK)
Heraeus, Hanau
II. M
ATERIAL UND
M
ETHODEN
15
Hier nicht aufgeführte Geräte werden in den entsprechenden Abschnitten weiter
unten erwähnt.
1.4 Verbrauchsmaterial und Sonstiges
Verbrauchsgegenstand Bezugsquelle
Cellulosefilter
Schleicher Schüll, Dassel
Einwegkanülen 23G Sterican
Braun, Melsungen
Einwegspritzen ERSTA, 1 ml
Cordan, Roedby (DK)
Filter Filtron MacrosepTM
VWR, Darmstadt
Kanülen
Henke Sass Wolf, Tuttlingen
Küvetten, Plastik, 1 ml
Sarstedt, Nümbrecht
Parafilm ,,M"® Laboratory Film
American National CanTM, Chicago, IL
(USA)
Petrischalen, Plastik
Greiner bio-one, Kremsmünster (A)
pH-Stäbchen VWR,
Darmstadt
Pipettenspitzen 10, 200 und 1000 µl
Sarstedt, Nümbrecht
Reaktionsgefäße 1,5 und 2 ml
Eppendorf, Hamburg
Reaktionsgefäße 1,5 und 2 ml mit
Schraubverschluß und Dichtung
Sarstedt, Nümbrecht
Sterilfilter Dyna Gard®, 0,2 µm
Roth, Karlsruhe
Glaswaren wurden von der Firma Schott, Mainz, bezogen.
II. M
ATERIAL UND
M
ETHODEN
16
2. Organismen
Stamm
Bezugsort
Bacillus spec. sporulierend
Bakterienbank Regensburg
Bacillus subtilis
Bakterienbank Regensburg
Bacillus thuringiensis
Bakterienbank Regensburg
Brevibacterium linens
Bakterienbank Regensburg
Chromobacterium violaceum
Bakterienbank Regensburg
Citrobacter amalonaticus
Bakterienbank Regensburg
Citrobacter freundii
Bakterienbank Regensburg
C1 (Laborstamm)
Bakterienbank Regensburg
CJ11049
KORDI, Ansan (KOR)
Cystodytes-Isolate CysB1, CysB2, CysB3,
CysB4, CysC2 und CysC5
Im Zuge dieser Arbeit isolierte Stämme
aus gesammelten und im Labor gehäl-
terten Tieren
Enterobacter aerogenes
Bakterienbank Regensburg
Enterococcus durans
Bakterienbank Regensburg
Enterococcus faecalis
Bakterienbank Regensburg
Enterococcus gallinarum
Bakterienbank Regensburg
Escherichia coli
Bakterienbank Regensburg
Escherichia coli K12
Bakterienbank Regensburg
M88-4d/5 Bakterienbank
Regensburg
Micrococcus spec.
Bakterienbank Regensburg
Pseudomonas aeruginosa
Universitäts-Klinikum Regensburg
PB2 Universität
Mainz
Staphylococcus carnosus
Bakterienbank Regensburg
Staphylococcus hyicus
Bakterienbank Regensburg
Staphylococcus spec.
KORDI, Ansan (KOR)
II. M
ATERIAL UND
M
ETHODEN
17
Streptococcus salivarius
Bakterienbank Regensburg
Streptococcus mutans
Bakterienbank Regensburg
Streptococcus sanguis
Bakterienbank Regensburg
Streptomyces spec.
Bakterienbank Regensburg
Yersinia enterocolitica
Bakterienbank Regensburg
Tab. II/1: verwendete Mikroorganismen
3. Nährmedien und Kulturbedingungen
3.1 Kulturbedingungen
Mit Ausnahme der Enterobacteriaceae (37°C, aerob) wurden alle verwendeten
Mikroben aerob im Rollerdrum bei 30°C inkubiert. Außer den marinen Organismen
C1, CJ11049, PB2 und M88-4d/5 (MB, C1- bzw. M88-4d/5-Kulturmedium, vgl. II.3.2)
wurden alle Stämme in LB bzw. THB angezogen.
3.2 Zusammensetzung der Medien
3.2.1 Allgemeine Lösungen
Synthethisches Meerwasser, SME (Stetter et al., 1983); modifiziert
NaCl 27,7
g
MgSO
4
x 7 H
2
O 7,0
g
MgCl
2
x 7 H
2
O 5,5
g
CaCl
2
x 2 H
2
O 1,5
g
KCl 0,65
g
II. M
ATERIAL UND
M
ETHODEN
18
NaBr 0,1
g
H
3
BO
3
0,03 g
SrCl
2
x 6 H
2
O 0,015
g
KJ 0,5
mg
H
2
O
bidest
ad 1000 ml
Vitamin-Stammlösung nach Wolfe (10x) (Balch et al., 1979)
Biotin
20 mg
81,9 µM
Folsäure
20 mg
45,3 µM
Pyridoxamindihydrochlorid (Vit. B
6
)
100 mg
386,0 µM
Thiamindihydrochlorid (Vit. B
1
)
50 mg
148,0 µM
Riboflavin (Vit. B
2
)
50 mg
133,0 µM
Nikotinsäure
50 mg
406,0 µM
DL-Calciumpantothenat
50 mg
105,0 µM
Cyanocobalmin (Vit. B
12
)
5 mg
3,7 µM
p-Aminobenzoesäure (PABA)
50 mg
365,0 µM
Liponsäure
50 mg
242,0 µM
H
2
O
bidest
ad 1000 ml
3.2.2 Marine Broth 2216 (MB)
Marine Broth 2216 (Becton Dickinson, Le Pont De Claix, F)
Pepton 5,0
g
Hefeextrakt 1,0
g
Eisen(III)-Citrat 0,1
g
NaCl 19,45
g
MgCl
2
(wasserfrei) 5,9
g
II. M
ATERIAL UND
M
ETHODEN
19
Na
2
SO
4
3,24
g
CaCl
2
1,8
g
KCl 0,55
g
NaHCO
3
0,16 g
KBr 0,08
g
SrCl
2
34,0
mg
H
3
BO
3
22,0
mg
Na
2
SiO
3
4,0
mg
NaF 2,4
mg
NH
4
NO
3
1,6 mg
Na
2
HPO
4
8,0 mg
H
2
O
bidest
ad 1000 ml
Marine Broth 2216 wurde als Fertiggemisch verwendet. Die Bouillon wurde ca. eine
Minute unter Rühren auf der Heizplatte gekocht und anschließend autoklaviert (vgl.
II.6).
3.2.3 Minimalmedien für C1
Glucose
[%]
Hefeextrakt
[%]
Casamino-
säuren [%]
Vitaminlö-
sung (10 x)
[%]
Nukleotide
[%]
Hefeextrakt
Fraktionen
[%]
a) 0,1; 0,5 bzw.
1,0
0,01; 0,05
bzw. 0,1
- - - -
b) 0,1; 0,5 bzw.
1,0
- 0,01;
0,05
bzw. 0,1
0,02; 0,1
bzw. 1,0
- -
c)
0,5 - 0,5 -
0,001
bzw.
0,01
-
d)
0,5 - - - - 0,1
Tab. II/2: Ansätze in 1 x SME mit 50 mM Tris-Cl, pH 7,5
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Details
- Arbeit zitieren
- , 2004, Charakterisierung des Bakterienisolates C1 aus Cystodytes dellechiajei, Hamburg, Bedey Media GmbH, https://www.diplom.de/document/223189
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