Untersuchungen zur Expression der Telomeraseuntereinheiten hTERC und hTERT in normalen und neoplastischem Nierengewebe

Diplomarbeit von Monika Fuchs

Zusammenfassung:

In den letzten Jahren wurde die Aktivierung der Telomerase, ein der natürlichen replikativen Seneszenz somatischer Zellen entgegenwirkendes Enzym, im Hinblick auf die Entstehung maligner Veränderung von Geweben aller Art stark diskutiert. Insbesondere aufgrund der ersten Befunde einer hohen Telomeraseaktivität in Karzinomen [Kim et al., 1994], nicht aber in normalen Geweben, ging man zunächst von einem Immortalisierungsprozess nicht-neoplastischer Zellen aus, der mit der Aktivierung der Telomerase einher geht. Man vermutete einen neuen Malignitätsmarker entdeckt zu haben, der für die Diagnostik bzw. für eine mögliche therapeutische Anwendbarkeit von Bedeutung sein würde.

Befunde von Telomerase-negativem neoplastischem Gewebe bzw. Telomerase-positivem nicht-neoplastischen Gewebe wirkten zunächst ernüchternd. Diese Fälle traten zwar in relativ geringen Prozentzahlen auf, waren jedoch nicht zu ignorieren. Eine der wahrscheinlichsten Ursachen liegt in dem heterogenen Aufbau der von Tumoren betroffenen Organe u.a. aus Tumor-, Stroma-, Endothel- und Entzündungszellen. Zudem können augenscheinlich nicht-neoplastische Areale eines solchen Organs bereits präkanzerogene Veränderungen aufweisen, die vom beurteilenden Pathologen nicht histomorphologisch festzustellen sind.

Das Ziel dieser Arbeit lag darin, detailiertere Erkenntnisse über die Regulation der Telomerase zu erlangen. Die Telomeraseaktivität, welche mittels des Telomerase-ELISA bestimmt wurde, spiegelte immer nur den Zustand eines Gewebehomogenats wieder. Aus diesem Grund sollten genauere Erkenntnisse durch die komparative Untersuchung der Telomeraseaktivität und der Expression der bislang klonierten Telomeraseuntereinheiten hTERC und hTERT innerhalb der Morphologie eines formalinfixierten Gewebeschnittes erlangt werden. Die Untersuchungen zur zellulären Zuordnung der Expression der Telomeraseuntereinheiten wurden auf RNA-Ebene mittels der Technik der nicht-radioaktiven in situ-Hybridisierung durchgeführt.

Die Expression von hTERC war in 82% der Nierenzellkarzinome und 88% des Kontrollgewebes positiv und meist nukleär ausgeprägt. Im Normalgewebe waren hauptsächlich die Kerne der Tubulusepithelzellen positiv, welche eine hohe Proliferationsaktivität besitzen. Für hTERC zeigte sich im Einklang mit den Literaturwerten keine Korrelation zur Telomeraseaktivität, was nicht für hTERC als einen limitierenden Faktor bei der Telomeraseaktivierung spricht.

Die Expression von hTERT war in 91% der Nierenzellkarzinome und in 100% der Kontrollgewebe positiv und eher cytoplasmatisch ausgeprägt, wobei die Kerne meist negativ waren. Auch hier konnte im Gegensatz zu den Literaturwerten keine Korrelation zu der Telomeraseaktivität beobachtet werden.

Es gelang die positiven Ergebnisse der RNA-in situ-Hybridisierung mit der RT-PCR, einem direkten Nachweisverfahren für die Telomeraseuntereinheiten zu bestätigen.

Obwohl die Telomerase als möglicher Ansatzpunkt für eine Krebstherapie denkbar wäre, bedarf es weiterer Studien, die genaue Funktion und den Aktivierungsmechanismus der Telomerase aufzuklären.

Inhaltsverzeichnis:

1.	Einleitung	1
1.1	Telomere	1
1.1.1	Telomeraufbau	1
1.1.2	Telomerfunktion	4
1.1.3	Das Endreplikationsproblem	5
1.2	Telomerase	7
1.2.1	Aufbau der Telomerase	12
1.2.2	Funktion der Telomerase	13
1.3	Telomeraseaktivität	14
1.4	RNA-in situ-Hybridisierung	15
1.5	RT-PCR	16
1.6	Fragestellung / Ziel der vorliegenden Arbeit	16
2.	Material und Methoden	17
2.1	Untersuchungsmaterial	17
2.1.1	Nierengewebe	17
2.1.2	Hodengewebe	20
2.2	Untersuchungsmethoden	20
2.2.1	Telomeraseaktivitätsnachweis	20
2.2.2	Untersuchung der Telomerase-Expression mittels der in situ-Hybridisierung	23
2.2.2.1	Vorsichtsmaßnahmen gegen die RNase-Aktivität	23
2.2.2.2	Herstellung der Paraffinschnitte für die RNA-in situ-Hybridisierung	24
2.2.2.2.1	Fixieren und Einbetten der Gewebestücke	24
2.2.2.2.2	Schneiden der Paraffinblöcke	25
2.2.2.2.3	Silanisieren der Objekträger	25
2.2.2.3	Herstellung der HE-Schnitte	25
2.2.2.4	RNA-in situ-Hybridisierung	27
2.2.2.4.1	Hybridisierungs-Mix	28
2.2.2.4.2	Oligonukleotid-Sonden	30
2.2.2.4.3	Positivkontrollen	32
2.2.2.4.4	Negativkontrollen	33
2.2.2.4.5	Detektion der Sonden	33
2.2.2.5	HE-Gegenfärbung	37
2.2.2.6	Apoptose-Färbung	37
2.2.3	Spezifischer Nachweis von hTERC und hTERT	38
2.2.3.1	Isolierung von Total-RNA aus Gewebe	38
2.2.3.2	Konzentrationsbestimmung der isolierten RNA	40
2.2.3.3	RT-PCR	41
2.2.3.3.1	Transkription der Total-RNA in cDNA	44
2.2.3.3.2	Amplifikation spezifischer cDNA-Sequenzen	45
2.2.3.4	Agarose-Gel-Elektrophorese	47
2.2.3.5	Aufnahme der Gele	48
3.	Ergebnisse	48
3.1	Telomeraseaktivität	48
3.2	RNA-in situ-Hybridisierung	50
3.2.1	Expressionsmuster von PolyA	51
3.2.2	Expressionsmuster der Telomeraseuntereinheit HTERC	51
3.2.3	Expressionsmuster der Telomeraseuntereinheit HTERT	52
3.2.4	Expressionsmuster	53
3.2.5	Aufnahmen	59
3.3	RT-PCR	76
3.4	Zusammenfassung aller Ergebnisse	78
4.	Diskussion	80
4.1	Methodische Aspekte	80
4.1.1	Telomeraseaktivitätsnachweis und RT-PCR	80
4.1.2	RNA-in situ-Hybridisierung	81
4.2	Vergleichende Betrachtung der Ergebnisse	84
4.2.1	Telomeraseaktivität	84
4.2.2	Spezifischer Nachweis der Telomeraseuntereinheiten	86
4.2.3	Diagnose- / Therapieansätze	89
5.	Zusammenfassung	91
6.	Verzeichnis der Abkürzungen	93
7.	Literatur	95