Untersuchungen zu Enzymen der Rosmarinsäurebiosynthese aus Zellkulturen von Anthoceros crispulus

Diplomarbeit von Martina Heim

Einleitung:

Rosmarinsäure ist ein typischer Naturstoff der Lamiaceae und Boraginaceae. Neuere Untersuchungen zeigen jedoch, dass dieser Naturstoff auch in anderen Pflanzenfamilien zu finden ist, darunter in den Lamiaceen und Boraginaceen nicht-direkt verwandten Farnen der Gattung Blechnum und in den Hornmoosen (Anthocerotaceae). Die Hornmoose bilden zusammen mit den Laub- und Lebermoosen die Abteilung der Moose (Bryophyta), die evolutionär gesehen an der Schwelle zwischen Thallophyten und Kormophyten stehen.

Die genaue Stellung der Hornmoose wird heute noch diskutiert; sie könnten als evolutionäre Reliktgruppe oder auch als Übergangsgruppe zu den höheren Landpflanzen eingeordnet werden. Umso interessanter ist der Aspekt, dass die Hornmoose denselben Naturstoff, Rosmarinsäure, bilden und akkumulieren wie Lamiaceae und Boraginaceae. Dies wirft die Frage auf, ob die Enzymatik der Biosynthese der Rosmarinsäure in den beiden Pflanzengruppen gleich und möglicherweise evolutionär verwandt sind.

In dieser Arbeit werden einige bereits bekannte Enzyme des Rosmarinsäurebiosyntheseweges (in Zellkulturen der Lamiaceae Coleus blumei gut charakterisiert und auch bereits in Anthoceros crispulus nachgewiesen) in Zellkulturen von Anthoceros crispulus näher untersucht. Dabei werden die Phenylalanin Ammoniun-Lyase (PAL) und die Hydroxyphenylpyruvat Reduktase (HPPR) charakterisiert. Die Tyrosin Aminotransferase (TAT), die die Transaminierung von Tyrosin zu 4-Hydroxyphenylpyruvat unter Einsatz des Aminoakzeptors 2-Oxoglutarat mit Entstehung von Glutamat katalysiert, wurde im Rahmen der Kulturcharakterisierung nachgewiesen. Die Hydroxyzimtsäure: CoALigase konnte nicht reproduzierbar gemessen werden.

Die PAL setzt Phenylalanin unter Freisetzung von NH3 zu t-Zimtsäure um. Für die PAL wurden die wichtigsten Enzymcharakteristika (wie Abhängigkeit von der Proteinkonzentration und Temperatur, pH-Optimum in verschiedenen Puffern, Fällungsbereich bei Ammoniumsulfatfällung, Lagerfähigkeit bei -20°C) mit Rohextrakten und gefälltem Protein als Enzymquelle ermittelt. Darüber hinaus wurden die Substratsättigungskurve und der Km-Wert für Phenylalanin bestimmt.

Die HPPR reduziert Hydroxyphenylpyruvat mit Hilfe von NAD(P)H zu Hydroxyphenyllactat. Die Charakterisierung dieses Enzyms wurde ebenfalls durchgeführt mit Proteinrohextrakten und Ammoniumsulfat-gefälltem Protein. Hier wurden im Wesentlichen dieselben Enzym-Charakteristika bestimmt wie für die PAL. Hierbei wurden zwei Substrate eingesetzt: 4-Hydroxyphenylpyruvat (pHPP) und 3,4-Dihydroxyphenylpyruvat (DHPP). Mit pHPP wurden durchweg geringere Enzymaktivitäten gemessen. Ebenfalls wurden zwei Reduktionsäquivalente verwendet (NADH, NADHPH), wobei mit NADH größere Umsatzraten erzielt wurden. Für pHPP und DHPP wurden dieselben Sättigungskonzentrationen und Km-Werte erzielt.

Weiterhin wurden im Rahmen der Kulturcharakterisierung der Suspensionskultur von Anthoceros crispulus Wachstums- und Medienparameter (in CB2- und CB4-Medium), sowie die Akkumulation von Rosmarinsäure und „Anthoceros-Substanz“ und die spezifischen Aktivitäten von PAL, TAT und HPPR bestimmt. Im Gegensatz zu Suspensionskulturen von Coleus blumei akkumuliert Anthoceros crispulus in CB2-Medium mit bis zu 6% des Zelltrockengewichtes mehr Rosmarinsäure als im CB4-Medium. PAL und TAT zeigten ihre höchsten Aktivitäten in den ersten Tagen der Kulturperiode, wogegen die HPPR kein ausgeprägtes Aktivitätsmaximum aufwies.

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