Untersuchung der körpereigenen Erythropoietin-Konzentration und der damit korrelierenden Parameter unter verschiedenen physiologischen Bedingungen

Dissertation / Doktorarbeit von Bettina Majer

Einleitung:

Humanes Erythropoietin (EPO) wurde erstmals 1977 von Miyake, Kung und Goldwasser aus dem Urin von Patienten mit aplastischer Anämie isoliert. Das humane endogene Glykoprotein EPO, das überwiegend in der Niere produziert wird, ist an der Differenzierung und Reifung der roten Blutzellen (Erythropoese) beteiligt.

Seit mehr als zehn Jahren wird dieses Hormon gentechnologisch hergestellt und als rekombinantes EPO (rhEPO) zu therapeutischen Zwecken eingesetzt. Es findet Anwendung bei der Behandlung renaler Anämie, aber auch bei der Steigerung der autologen Blutgewinnung bei Patienten, die an einem Spendeprogramm zur Vermeidung von Fremdblutkonserven teilnehmen, so z.B. bei größeren operativen Eingriffen, die einen großen Blutvolumenersatz fordern.

1991 konnte Ekblom und später auch Audran zeigen, dass die Injektion von rhEPO bei gesunden trainierten Athleten zu einer Zunahme des Hämatokritwerts, der Hämoglobin-Konzentration sowie zu einer Erhöhung der maximalen Sauerstoffaufnahmefähigkeit führt. Parallel dazu konnte eine Steigerung der maximalen Leistungsfähigkeit aufgezeigt werden.

Der Missbrauch von gentechnisch hergestelltem EPO birgt Gefahren. Ein stark erhöhter Hämatokritwert kann eine Erhöhung der Blutviskosität verursachen, die wiederum u.a. das Thromboserisiko steigert. Bereits 1990 wurde gentechnisch hergestelltes EPO vom Internationalen Olympischen Komitee (IOC) auf die Liste der verbotenen Substanzen gesetzt, obwohl zu diesem Zeitpunkt noch keine Methode zum direkten Nachweis des Missbrauchs von rhEPO zur Verfügung stand.

Die UCI (Union Cycliste Internationale) und die FIS (Fédération Internationale de Ski) führten ab 1997 zufällige Blutkontrollen vor Wettkämpfen ein, um dem Missbrauch von rhEPO entgegenzuwirken. Bis heute werden bei diesen Kontrollen die Blutparameter Hämatokrit bzw. Hämoglobin gemessen, die als sog. indirekte Marker eines rhEPO-Missbrauchs fungieren. Die Verbände legten für diese Blutparameter Grenzwerte fest. Im Falle einer Überschreitung der Grenzwerte wird der Athlet aus gesundheitlichen Gründen von dem laufenden Wettkampf ausgeschlossen und erhält eine zweiwöchige Startsperre.

Um schon im Vorfeld einer möglichen Anwendung der Dopingsubstanz EPO deren Wirkungen und Nebenwirkungen abschätzen zu können, ist es notwendig, die normalen Wechselwirkungen zwischen körperlicher Arbeit und Training einerseits und EPO-Produktion und EPO-Plasmakonzentration andererseits zu kennen. Da aber in der Literatur kaum Daten darüber existieren, inwieweit sich die körpereigene EPO-Konzentration und die damit korrelierenden Parameter unter verschiedenen physiologischen Bedingungen bei gesunden Sportlern verändern und um zugleich die Ergebnisse der Blutparameter, die bei den o.g. Kontrollen ermittelt werden, besser interpretieren zu können, führte das Institut für Biochemie an der Deutschen Sporthochschule Köln eine Reihe vom Internationalen Olympischen Komitee (IOC) unterstützter Grundlangenstudien durch, die sich mit dieser Fragestellung systematisch befassten. Es wurden folgende Teiluntersuchungen durchgeführt:

- Untersuchung der circadianen Rhythmik von Erythropoietin und der damit korrelierenden Parameter der Erythropoese.

- Untersuchung der Jahresrhythmik von Erythropoietin und der damit korrelierenden Parameter der Erythropoese.

- Untersuchungen des Einflusses von sportlicher Ausdauerbelastung (Radrennen und Marathon) unter Wettkampfbedingungen auf die Erythropoietin-Konzentration und der damit korrelierenden Parameter.

- Untersuchung des Einflusses von Langzeitflügen auf die Erythropoietin-Konzentration und der damit korrelierenden Parameter.

Die generierten Daten der o.g. Teiluntersuchungen und die daraus gewonnenen Ergebnisse werden in der vorliegenden Arbeit diskutiert. Zudem werden die Daten eines Interlabor-Versuchs besprochen, der im Hinblick auf die Vergleichbarkeit der Daten, aus den verschiedenen IOC akkreditierten Laboratorien, durchgeführt wurde.

Zusammenfassung:

Seit dreißig Jahren zählt Blutdoping zu den bedeutsamsten Dopingproblemen im Ausdauersport. Es ermöglicht eine Leistungssteigerung und ist gleichzeitig äußerst schwierig nachzuweisen. Anfänglich wurde Blutdoping in Form von homologen und autologen Bluttransfusionen durchgeführt. Ende der achtziger Jahre löste das gentechnisch hergestellte Hormon Erythropoietin (rhEPO) diese Form des Blutdopings ab. Der Missbrauch von gentechnisch hergestelltem EPO birgt Gefahren. Ein stark erhöhter Hämatokritwert kann eine Erhöhung der Blutviskosität verursachen, die wiederum u.a. das Thromboserisiko steigert. Bereits 1990 wurde gentechnisch hergestelltes EPO vom Internationalen Olympischen Komitee (IOC) auf die Liste der verbotenen Substanzen gesetzt.

Um dem Missbrauch von rhEPO erfolgreich entgegen zuwirken, ist es notwendig, die normalen Wechselwirkungen zwischen körperlicher Arbeit und Training einerseits und EPO-Produktion und EPO-Plasmakonzentration andererseits zu kennen. Zu diesem Zweck wurden in der vorliegenden Arbeit die Ergebnisse von 5, vom Internationalen Olympische Komitee (IOC) unterstützten Grundlagenstudien zusammengefasst, die sich mit dieser Fragestellung befassten. Dabei wurden die endogene Erythropoietin-Konzentration und verschiedene Blutparameter bei gut bis sehr gut trainierten Atleten/innen im Hinblick auf eine Tagesrhythmik, einer Jahresrhythmik, unter dem Einfluß von Wettkampfbedingungen (Radrennen und Marathon) und unter dem Einfluß von Hypoxiebedingungen auf Langstreckenflügen untersucht und ausgewertet. Den von verschiedenen Verbänden und dem Internationalen Olympischen Komitee zur Dopingprävention herangezogenen Blutparametern Hct, Hb und %Reti wurde in dieser Arbeit besondere Beachtung geschenkt.

Es zeigte sich, dass die endogene EPO-Konzentration im Serum eine circadiane Rhythmik aufweist, die unabhängig von der Sportart, dem Leistungsniveau sowie dem Geschlecht ist. Zudem scheint die circadiane Rhythmik unbeeinflusst von der Trainingsaktivität bzw. dem Ernährungs- und Hydratationszustand der Athleten zu sein.

Der Kurvenverlauf der circadianen Rhythmik ist bei beiden Geschlechtern vergleichbar. Die Amplitude ist bei den Frauen höher als bei den Männern. Die höchste EPO-Konzentration wird in den Abendstunden registriert, die niedrigste Konzentration in den Morgenstunden.

Über einen Zeitraum von 12 Monaten betrachtet, bestätigte sich die signifikant höhere EPO-Konzentration bei den Frauen. Ebenfalls wirkten sich über diese Zeitspanne die ausgeübte Sportart und der Trainingszustand nicht signifikant auf die EPO-Konzentration aus.

Unter dem Einfluss von Wettkampfbedingungen kann weder bei einem Radrennen noch bei einem Straßenmarathon ein geschlechtsspezifischer Unterschied bezüglich der EPO-Konzentration gefunden werden. Auch veränderte die körperliche Belastung selbst den EPO-Spiegel nicht signifikant. Zu demselben Ergebnis führte die Untersuchung des Einflusses von Hypoxiebedingungen auf Langstreckenflügen.

Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass mit Ausnahme der EPO-Konzentration die übrigen untersuchten hämatologischen Parameter weder einer tages- noch einer jahreszeitlichen Rhythmik folgen. Dennoch konnten auch bei diesen Parametern signifikante Veränderungen registriert werden, die z.T. durch die ausgeübte Sportart oder durch akute Veränderungen von Blut- und Plasmavolumen erklärbar sind.

Die signifikanten Veränderungen der untersuchten hämatologischen Parameter unter dem Einfluss sportlicher Ausdauerbelastung unter Wettkampfbedingungen konnten als Indizien für eine belastungsinduzierte Steigerung der Erythropoese und der damit korrelierenden Parameter gewertet werden. In welcher Komplexität dabei die Kaskade hormoneller Regulationsprozesse durch die physische Beanspruchung ausgelöst wurde, konnte allerdings nicht beurteilt werden.

Die Untersuchung des Einflusses von Hypoxiebedingungen auf Langzeitflügen auf die korrelierenden Parameter der Erythropoese erbrachte ebenfalls signifikante Ergebnisse. Diese, auf Flüssigkeitsverschiebungen beruhenden Veränderungen, zeigen aber keinen direkten Einfluss auf die Erythropoeseaktivität.

Bei allen fünf Teilstudien zeigte sich, dass die Werte der Athleten eine große interindividuelle Streuung der Ergebnisse gegenüber einer geringen intraindividuellen Streuung aufwiesen. Es zeigte sich zudem, dass die durch UCI, FIS und IOC gesetzten Grenzwerte schon physiologisch bei einzelnen Personen, unabhängig vom Leistungsniveau oder Sportart, überschritten wurden. Dies sollte zu einem Paradigmenwechsel in der Dopinganalytik führen. Weg von einem undifferenzierten Grenzwertdenken hin zu einer individuellen Verlaufskontrolle des einzelnen Athlethen. Wenn sich in der Verlaufsbeobachtung Auffälligkeiten zeigen, so können durch Zusatzuntersuchungen gezielte Antidopingtests eingesetzt werden. Dies steigert die Effizienz der Dopinganalytik in allen Bereichen und führt nicht zuletzt zu einer Steigerung der Fairness im Hochleistungssport.

Inhaltsverzeichnis:

1.	Einleitung	1
2.	Literaturbesprechung	3
2.1	Historischer Hintergrund von Erythropoietin	3
2.2	Molekularstruktur von EPO	5
2.3	Regulation der Erythropoese	7
2.4	Morphologische Zellveränderungen während der Erythropoese	9
2.5	Abbau von Erythropoietin	10
2.6	Einflussfaktoren der Erythropoese	11
2.7	Korrelierende Parameter der Erythropoese	12
2.8	Rekombinantes Erythropoietin (rhEPO)	19
2.9	Erythropoietin und Sport	22
3.	Material und Methoden	25
3.1	Studiendesign	25
3.2	Zielpopulation / Probandengut	32
3.3	Bestimmung von Erythropoietin	36
3.4	Bestimmung von Ferritin und löslichen Transferrinrezeptor	38
3.5	Linearitätsbereiche und Probenvolumen des Advantages	38
3.6	Gesamtprotein Bestimmung	38
3.7	Bestimmung der hämatologischen Parameter	39
3.8	Präzision	42
3.9	Analytische Sensitivität (Nachweis- und Bestimmungsgrenze)	45
4.	Ergebnisse	47
4.1	Untersuchung der circadianen Rhythmik von Erythropoietin und der damit korrelierenden Parameter der Erythropoese (Tagesstudie)	47
4.2	Untersuchung der Jahresrhythmik von Erythropoietin und der damit korrelierenden Parameter der Erythropoese (Jahresstudie)	109
4.3	Untersuchung des Einflusses von sportlicher Ausdauerbelastung unter Wettkampfbedingungen auf die Erythropoietin-Konzentration und der damit korrelierenden Parameter am Beispiel eines Straßenradrennens	162
4.4	Untersuchung des Einflusses von sportlicher Ausdauerbelastung unter Wettkampfbedingungen auf die Erythropoietin-Konzentration und der damit korrelierenden Parameter am Beispiel eines Stadtmarathons	189
4.5	Untersuchung des Einflusses von Langzeitflügen auf die Erythropoietin-Konzentration und der damit korrelierenden Parameter (Hypoxie-Studie)	214
4.6	Interlabor-Vergleich	240
5.	Diskussion	244
5.1	Diskussion der Untersuchungsergebnisse zur circadiane Rhythmik von Erythropoietin und der damit korrelierenden Parameter der Erythropoese (Tagesstudie)	244
5.2	Diskussion der Untersuchungsergebnisse zur Jahresrhythmik von Erythropoietin und der damit korrelierenden Parameter der Erythropoese (Jahresstudie)	254
5.3	Diskussion der Untersuchungsergebnisse zum Einfluss von sportlicher Ausdauerbelastung unter Wettkampfbedingungen auf die Erythropoietin-Konzentration und der damit korrelierenden Parameter am Beispiel eines Straßenradrennens	260
5.4	Diskussion der Untersuchungsergebnisse zum Einfluss von sportlicher Ausdauerbelastung unter Wettkampfbedingungen auf die Erythropoietin-Konzentration und der damit korrelierenden Parameter am Beispiel eines Stadtmarathons	264
5.5	Diskussion der Untersuchungsergebnisse zum Einfluss von Langzeitflügen auf die Erythropoietin-Konzentration und der damit korrelierenden Parameter (Hypoxie-Studie)	268
5.6	Diskussion der Ergebnisse des Interlabor-Vergleichs	273
6.	Zusammenfassung	275
7.	Literaturverzeichnis	278
8.	Anhang	297

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