Struktur- und Funktionsanaloga der Cu,Zn-Superoxid-Dismutase

Dissertation / Doktorarbeit von Jörg Müller

Zusammenfassung:

Neun neue Kupfer-Di-Schiff-Basen-Komplexe wurden erstmals synthetisiert und mit der Reaktivität bekannter Komplexe wie [Cu(II)PuPy](ClO4)2, [Cu(II)PuACPy] ](ClO4)2 und [Cu(II)(phen)2]Cl2 verglichen.

Alle Komplexe wurden chemisch und spektroskopisch (UV/Vis, ESR, AAS, IR) charakteri-siert. Von fünf Kupfer-Di-Schiff-Basen gelang es Einkristalle zu isolieren und Kristall-strukturen aus Röntgenbeugungsdaten zu berechnen.

Bezüglich der physikochemischen Eigenschaften kommt [Cu(II)PuPhePy](ClO4)2 der Cu,Zn-Superoxid-Dismutase (SOD) am nächsten. Auch die Kristallstruktur zeigt eine dem aktiven Zentrum der SOD sehr ähnliche Koordinationsgeometrie des Kupfers.

Für den SOD-aktivsten der Komplexe, [Cu(II)PuPhePy](ClO4)2, wurde im Nitrotetrazolium-blau Test mit einer Halbwertshemmkonzentration (IC50) von 0,27 µM 3 % der Aktivität des Enzyms gemessen. Der Komplex reagiert mit pulsradiolytisch erzeugtem Superoxid in Gegenwart eines vierfachen Überschusses an EDTA mit einer Geschwindigkeit von k2 = 0,48 x 109 M-1 s-1 und liegt damit in der gleichen Größenordnung wie intakte Cu,Zn-SOD. Die thermodynamische Stabilität ist mit log K von 18,33 bei pH 7 um zwei Größenordnungen höher als die von Cu(II)EDTA oder Cu(II)Serumalbumin.

Damit ist [Cu(II)PuPhePy](ClO4)2 nicht nur einer der aktivsten SOD Funktions- und Strukturanaloga, sondern er ist auch gegen Hydrolyse bei pH 5 - 8 und gegenüber kompetitiven Biochelatoren außerordentlich stabil.

Neben der SOD-Aktivität ist [Cu(II)PuPhePy](ClO4)2 membrangägngig, Fenton-aktiv und spaltet DNA in vitro mit einer ähnlichen Reaktivität wie [Cu(II)(phen)2]Cl2, eine der effektivsten Nuklease-mimetischen Verbindungen. Der Komplex ist bezüglich Interkalation und Oxidation von DNA im Ames Test in vivo nicht mutagen und im Blut gegenüber Serumalbumin stabil (intravenöse Anwendung). Aufgrund seiner intrazellulären Reaktivität, die speziell für oxidationsempfindliche Krebszellen schädlich ist, stellt [Cu(II)PuPhe-Py](ClO4)2 ein potentielles Therapeutikum für die Krebsbehandlung dar.

Die Zelltoxizität von [Cu(II)PuPhePy](ClO4)2 liegt mit einer LC50 von 20 µM bei 5-stündiger Inkubation von Rattenhepatozyten bezüglich der Kupferkonzentration im physiologischen Bereich. Therapeutische Dosen sollten daher keine Osmose-Phänomene zur Folge haben.

Zusammenfassend stellt [Cu(II)PuPhePy](ClO4)2 in oxidativer Umgebung eines der besten SOD-Mimetika und in reduktiver Umgebung ein wirksames Fenton-Reagenz dar. Beide Anwendungen sind durch die Wahl der äußeren Bedingungen möglich.

Inhaltsverzeichnis:

1.	Einleitung	1
1.1	Reaktive Sauerstoffspezies	1
1.2	Kupfer,Zink-Superoxid-Dismutase	9
1.3	Cu2Zn2-Superoxid-Dismutase-mimetische Komplexe	17
1.4	Übergangsmetallkomplexe als Nukleasen	29
1.4.1.	Interkalierende Metallkomplexe	29
1.4.2.	"Kovalent" bindende Koordinationsverbindungen	42
1.5	Zelltoxizität von Kupferverbindungen	46
1.6	Engere Problematik	51
2.	Material und Methoden	53
2.1.	Chemikalien	53
2.2.	Geräte	55
2.3.	Präparatives	56
2.3.1.	Liganden	56
2.3.2.	Kupferkomplexe	60
2.3.3.	Zinkkomplex	67
2.3.4.	Oktanol/Wasser-Verteilungskoeffizient	68
2.3.5.	Rattenhepatozyten	69
2.4.	Spektroskopie	70
2.4.1.	Infrarotspektroskopie	70
2.4.2.	Circulardichroismus	70
2.4.3.	Elektronenabsorption	70
2.4.4.	Atomabsorption	71
2.4.5.	Elementaranalysen	72
2.4.6.	Elektronenspinresonanz	72
2.4.7.	Kristallstrukturen	73
2.4.8.	Zyklovoltammetrie	73
2.5.	Biochemische Analytik	74
2.5.1.	Pulsradiolyse	74
2.5.2.	Nitrotetrazoliumblau Test	74
2.5.3.	Thiobarbitursäure Test	76
2.5.4.	Tetrazoliumblau Test (3-[4,5- Dimethyl-thiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid = MTT)	77
2.5.5.	Lactat-Dehydrogenase Test	78
3.	Ergebnisse und Diskussion	79
3.1.	Präparatives	79
3.1.1.	Liganden	79
3.1.2.	Komplexe	79
3.2.	Physikochemische Eigenschaften	84
3.2.1.	Infrarotspektroskopie	84
3.2.2.	Elektronenabsorption	93
3.2.3.	Elementaranalysen und Atomabsorption	96
3.2.4.	Elektronenspinresonanz	99
3.2.5.	Redoxpotentiale	101
3.3.	Kristalstrukturen	105
3.4.	Enzymatische Aktivität der Kupferkomplex	120
3.4.1.	Nitrotetrazoliumblau Test	120
3.4.2.	Pulsradiolyse	127
3.5.	Thermodynamische Stabilität der Kupferkomplexe	129
3.5.1.	Thermodynamische Gleichgewichtskonstanten	129
3.5.2.	Nitrotetrazoliumblau Test	134
3.5.3.	Elektronenspinresonanz	140
3.6.	DNS-Spaltung durch Kupferkomplexe	143
3.6.1.	Thiobarbitursäure Test	143
3.7.	Membrangängigkeit	145
3.7.1.	Oktanol/Wasser-Verteilungskoeffizient	145
3.8.	Zelltoxizität	149
3.8.1.	Tetrazoliumblau Test (3-[4,5- Dimethyl-thiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid = MTT)	150
3.8.2.	Lactat-Dehydrogenase Test	153
4.	Schlußfolgerung	155
5.	Zusammenfassung	168
6.	Literatur	170
7.	Anhang	197