Stabilität hoher Fluorchinolonresistenz bei Enterobakterien ohne Selektionsdruck

Dissertation / Doktorarbeit von Ansgar Schulte

Beide Auszeichnungen wurden auf Vorschlag der Paul-Ehrlich-Gesellschaft für Chemotherapie e.V. verliehen. Der Aventis Travel Award 2001 war ein Stipendium zum Besuch der 40th ICAAC, Toronto, Kanada, gestiftet von Aventis Pharma GmbH.

Zusammenfassung:

Als Präventivmaßnahme zur Eindämmung der Resistenz gegen Antibiotika wurde 1995 von der WHO vorgeschlagen, den Antibiotikaeinsatz weltweit zu reduzieren, um damit der Selektion von resistenten Bakterien entgegenzuwirken. Grundlage dieser WHO-Empfehlung ist die Annahme, daß die Fitness von Antibiotika-resistenten Mutanten im Vergleich zu sensitiven Stämmen signifikant verringert ist und diese daher beim Wegfall des Selektionsdrucks die resistenten Stämme verdrängen.

Die klinische Fluorchinolonresistenz bei Escherichia coli ist eine Folge der Akkumulation von Mutationen in den Genen der Zielstrukturen Gyrase und Topoisomerase IV. Des weiteren spielt oftmals eine Veränderung der mar-regulierten Expression von Porinen und Effluxpumpen eine Rolle. Bei in vitro selektierten E. coli konnte, im Zusammenhang mit der Resistenzentwicklung, eine erhebliche Verminderung der Fitness festgestellt werden. Neben einer verlängerten Generationszeit, wurde die Abnahme des negativen Superspiralisierungsgrads der DNA, sowie der Verlust der Typ 1 Fimbrienexpression festgestellt. Dies steht im Gegensatz zu den Befunden bei klinischen Isolaten.

Um die Frage zu klären, ob der Fitnessverlust der Bakterien die WHO-Annahme bestätigt, oder, ob eventuell kompensatorische Mutationen diesen Fitnessverlust ausgleichen können, wurde in dieser Arbeit ein Fitness-Kompensationsexperiment durchgeführt. Es bestand darin, die Ciprofloxacin-resistenten Zellen über 300 Generationen ohne Antibiotikaselektionsdruck in vitro zu kultivieren, dabei setzten sich die fittesten Mutanten durch. Es wurde somit auf Wachstumsgeschwindigkeit und Lebensfähigkeit selektiert.

Es konnte gezeigt werden, daß eine Generationszeitverkürzung bei Mutanten der Generation 300 auf Wildtyp-Niveau, mit der Wiederherstellung des DNA-Superspiralisierungsgrads einherging. Gleichzeitig blieb die klinische Chinolonresistenz erhalten. Die bekannten Resistenzmutationen in gyrA, parC und marR blieben unverändert. Zusätzlich war bei den untersuchten Mutanten der Generation 300 die Fähigkeit zur Typ 1 Fimbrienexpression wiederhergestellt.

Entsprechend dem Mehrschrittmechanismus der zur hohen Chinolonresistenz und zur phänotypischen Ausprägung des Fitnessverlustes führte, konnte in dieser Arbeit auch ein Mehrschrittmechanismus der Kompensation nachgewiesen werden. Die phänotypischen Unterschiede zwischen den Mutanten der Generation 300 bestand neben der 2min kürzeren Generationszeit der später identifizierten Stämme (MasIII300-16s und MasIV300-32s), in deren Verringerung der MHK-Werte gegenüber Ciprofloxacin, Tetracyclin und Chloramphenicol, sowie in der erhöhten Chinolonaufnahme. Diese Revertierung des sogenannten MAR-Phänotyps bei den Mutanten MasIII300-16s und MasIV300-32s fand wie erwartet ohne Veränderung der Deletion in marR statt. Statt dessen führte die DNA-Sequenzanalyse des marCORAB-Locus der Mutanten zur Identifizierung von kompensatorischen Mutationen im marA-Gen.

Falls die nachgewiesenen Mutationen in marA zu einer Inaktivierung des Transkriptionsaktivators marA führen, könnten diese nicht nur zu einer erhöhten Chinolonaufnahme und dadurch zu einer niedrigeren Ciprofloxacin-MHK führen, sondern zusätzlich durch die vermehrte Expression der OmpF-Porine zu einer verbesserten Nährstoffversorgung der Zelle beitragen. Dies würde die um 2min verkürzte Generationszeit der Mutanten MasIII300-16s und MasIV300-32s gegenüber den Mutanten MasIII300 und MasIV300 erklären.

Aufgrund der Fitnesskompensation wird die von der WHO in Genf empfohlene Reduzierung des Antibiotika-Einsatzes wegen des Zusammenhangs zwischen der Häufigkeit von resistenten Krankheitserregern und der Intensität der Antibiotikaanwendung zwar eine hilfreiche Maßnahme sein, wird aber wahrscheinlich, auch aufgrund der in dieser Arbeit gezeigten Ergebnisse bei E. coli, den einmal in Gang gesetzten weltweiten Prozeß der Resistenzselektion nicht umkehren können.

Inhaltsverzeichnis:

	Inhalt
1.	Einleitung	4
1.1	Bakterienfitness	5
1.2	Typ 1 Fimbrien	7
1.3	Enterobacteriaceae	9
1.4	Fluorchinolone	10
1.4.1	Wirkmechanismus der Fluorchinolone	11
1.4.2	DNA-Superspiralisierung	12
1.4.3	Chinolonresistenz	14
1.5	Zielsetzung	17
2.	Material und Methoden	18
2.1	Material	18
2.1.1	Bakterienstämme	18
2.1.2	Eukaryontenzellen	19
2.1.3	Vektoren	19
2.1.4	Oligonukleotide	20
2.1.5	DNA-Größenmarker	22
2.1.6	Nährmedien	22
2.1.7	Chemotherapeutika	22
2.1.8	Chemikalien	23
2.1.9	Enzyme	24
2.1.10	Puffer und Lösungen	25
2.1.11	Geräte und Material	26
2.2	Methoden	27
2.2.1	Konzentrationsbestimmung von Oligonukleotiden	27
2.2.2	Polymerase-Ketten-Reaktion	27
2.2.3	PCR des regulatorischen Bereichs der Typ1 Fimbrien	29
2.2.4	Isolierung von Plasmid-DNA	30
2.2.5	Agarose-Gelelektrophorese	31
2.2.6	Aufreinigung der DNA mit dem QIAquick-PCR Purification Kit	32
2.2.7	Spektralphotometrische Konzentrationsbestimmung von DNA	32
2.2.8	Sequenzierung von DNA	33
2.2.9	Enzymatische Modifikation von DNA	34
2.2.10	Herstellung kompetenter Bakterien und Transformation	35
2.2.11	Konjugation	35
2.2.12	Identifizierung der Bakterien durch Mikronaut E	36
2.2.13	Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration	37
2.2.14	Aufnahme von Ciprofloxacin in die Bakterienzellen	37
2.2.15	Keimzahlbestimmung	39
2.2.16	Bestimmung der Generationszeit	39
2.2.17	Fitness-Kompensationsexperiment	40
2.2.18	Direkter Wachstumsvergleich in einer Kultur	40
2.2.19	Mannose-sensible Saccharomyces cerevisiae Agglutination	41
2.2.20	Präparation der -Laktamase	41
2.2.21	Bestimmung der spezifischen -Laktamase-Aktivität	42
2.2.22	Proteinbestimmung nach Lowry	43
2.2.23	Bestimmung des DNA-Superspiralisierungsgrads über (-Laktamase-Expression	43
2.2.24	Bestimmung des DNA-Superspiralisierungsgrads über Chloroquingele	45
2.2.25	Proteomanalyse mittels 2D-Elektrophorese	46
2.2.25.1	Probenvorbereitung	46
2.2.25.2	Isoelektrische Fokussierung	46
2.2.25.3	SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese	47
2.2.25.4	Coomassiefärbung	48
2.2.25.5	Silberfärbung	49
2.2.25.6	Bildauswertung der 2D-Elektrophoresegele	49
2.2.25.7	Peptide Mass Fingerprinting Analyse mit MALDI-MS	50
3.	Ergebnisse	51
3.1	Fitnesskompensation	51
3.1.1	Bestimmung der Generationszeit ausgewählter Stämme	51
3.1.2	Fitness-Kompensationsexperiment	53
3.1.3	Generationszeitbestimmung als Berechnungsgrundlage	54
3.2	Charakterisierung der Mutanten nach 300 Generationen	54
3.2.1	Identifizierung der Keime mittels Micronaut-E-System	54
3.2.2	Bestimmung der Generationszeit	55
3.2.3	Direkter Wachstumsvergleich in einer Kultur über 10,5 Tage	56
3.2.4	MHK-Bestimmung der Mutanten nach 300 Generationen	60
3.2.5	MHK-Bestimmung mittels Micronaut-S-System	61
3.2.6	Bestimmung der Resistenzmutationen im Vergleich zu den Elternzellen	62
3.3	Multiple Antibiotika-Resistenz	63
3.3.1	Bestimmung des MAR-Phänotyp	63
3.3.2	Messung des Ciprofloxacingehaltes in der Bakterienzelle	64
3.3.3	Sequenzvergleich des marCORAB-Locus	66
3.4	Untersuchung der Adhärenzeigenschaften der E. coli-Isolate	67
3.4.1	Mannose-sensible Saccharomyces cerevisiae Agglutination (MSSA)	67
3.4.2	PCR des regulatorischen Bereichs der Typ 1 Fimbrien	68
3.5	Untersuchung des DNA-Superspiralisierungsgrads	70
3.5.1	Untersuchung des DNA-Superspiralisierungsgrads mittels Expression der (-Laktamase	70
3.5.2	Untersuchung des Superspiralisierungsgrads mit Chloroquingelen	72
3.5.3	DNA-Sequenzanalyse der Topoisomerasen und DNA-Bindeproteine	73
3.5.4	Überprüfung der Mutation in gyrA an Position 678	74
3.6	Proteomanalyse mittels 2D-Elektrophorese	74
3.6.1	Proteinexpressions-Unterschiede der Mutanten	75
3.6.2	Sequenzanalyse des Protein-codierenden Gens (yqgE)	77
3.6.3	Sequenzanalyse des Transkriptionsaktivators fadR	77
4.	Diskussion	78
5.	Zusammenfassung	95
6.	Literaturverzeichnis	97
7.	Anhang	106
7.1	Lebenslauf	106
7.2	Danksagungen	107
7.3	Abkürzungsverzeichnis	108