Produktion des rekombinanten, menschlichen Wachstumshormons aus CHO-Zellen im 2 Liter Perfusionsbioreaktor mit Plattensedimenter

Diplomarbeit von Werner Höra

Einleitung:

Unter Biotechnologie versteht man unter anderem die Herstellung von Lebensmitteln (z.B. Brot, Käse, Bier und Wein) oder Medikamenten (z.B. Antibiotika, rekombinante Proteine) aus biologischen Systemen im industriellen Maßstab.

Ein Teil der Biotechnologie wird als rote oder auch pharmazeutische Biotechnologie bezeichnet. Hierbei werden Medikamente wie z.B. Interleukine, Interferone, Erythropoietin, t-PA (tissue-plasminogen activator) oder monoklonale Antikörper in Prokaryoten und niederen Eukaryoten sowie in tierischen Zellen produziert. Ein Nachteil der Expression von Proteinen in Bakterien oder Hefen ist, dass sie keine oder keine korrekten, posttranslationalen Modifikationen wie Glykosylierungen oder Phosphorylierungen durchführen. Manche Proteine benötigen jedoch das Anhängen von Zuckerseitenketten, um ihre biologische Wirkung zu entfalten. Deshalb werden Säugetierzellen zur Herstellung von rekombinanten Proteinen eingesetzt, die diese, den Menschen annähernd gleichen, posttranslationalen Modifikationen, durchführen. Ein weiteren Grund für den Einsatz von tierischen Zellen zur Proteinherstellung ist, dass sie das Protein biologisch aktiv ins Nährmedium ausschleusen.

Das Ziel dieser Arbeit war es, das rekombinante, humane Wachstumshormon aus CHO-Zellen (chinese hamster ovary-Zellen) herzustellen. Bis auf einen Prozess der Firma Ares-Serono Pharma (Schweiz), wo das Protein in der adhärent wachsenden Maustumorzelllinie C127 produziert wird, erfolgt die Herstellung des menschlichen Wachstumsfaktors industriell bis heute in E. coli-Zellen. Diese besitzen eine kürzere Verdopplungszeit als Säugetierzellen, sezernieren den menschlichen Wachstumsfaktor jedoch nur ins Periplasma, wo er in Form von Einschlusskörperchen vorliegt. In kostspieligen und zeitaufwendigen Aufarbeitungsschritten müssen die Zellen nach der Fermentation aufgeschlossen und das Protein de- sowie renaturiert werden. Hierbei entstehen große Produktverluste.

Als Fermentationsbetriebsweise wurde ein Perfusionsprozess mit einem 2 Liter Bioreaktor gewählt. Es sollte ein Laborprozess etabliert werden, mit dem eine deutlich höhere Produktkonzentration hergestellt werden konnte, als in T-Flaschen, Spinnern, Superspinnern oder Bioreaktorsatzprozessen möglich war. Als Zellrückhaltungsgerät wurde dabei ein Plattensedimenter (englisch: inclined settler) verwendet.

Inhaltsverzeichnis:

1.	Einleitung und Zielsetzung	1
2.	Theoretischer Hintergrund	2
2.1	Das menschliche Wachstumshormon	2
2.2	Einsatzgebiete des menschlichen Wachstumshormons	5
2.3	Allgemeine Grundlagen des Perfusionsprozesses	9
2.4	Der Plattensedimenter als Zellrückhaltungsgerät	10
3.	Material und Methoden	13
3.1	Die Zelllinie	13
3.2	Die Zellkulturmedien	14
3.3	Vorgehensweise	14
3.4	Die Kultivierungsysteme	15
3.4.1	Die T-Flaschen	15
3.4.2	Die Spinner	15
3.4.3	Der Superspinner	15
3.4.4	Der 2 Liter Satzbioreaktor	16
3.4.5	Der 2 Liter Perfusionsbioreaktor mit Plattensedimenter	17
3.4.5.1	Der Aufbau des Perfusionsbioreaktors	17
3.4.5.2	Kinetiken des Perfusionsprozesses	21
3.5	Fermentationsanalytik	24
3.5.1	Bestimmung der Lebendzelldichte und der Viabilität	24
3.5.2	Bestimmung der Glucose- und Lactatkonzentration	25
3.5.3	Bestimmung der Ammoniumkonzentration	25
3.5.4	Bestimmung der externen Aminosäurekonzentration	26
3.5.5	Bestimmung der Produktkonzentration	26
3.6	Kryokonservierung	27
4.	Ergebnisse und Diskussion	28
4.1	Die Vorversuche in T-Flaschen und Spinnern	28
4.2	Die Kultivierung im Superspinner	28
4.3	Die wiederholte Satzkultivierung im 2 Liter Bioreaktor	29
4.3.1	Wachstum und Produktbildung in der wiederholten Satzkultivierung	29
4.3.2	Substratverbrauch in der wiederholten Satzkultivierung	32
4.3.3	Nebenproduktbildung in der wiederholten Satzkultivierung	34
4.3.4	Aminosäurekonzentrationen und spezifische Aminosäureverbrauchsraten in der wiederholten Satzkultivierung	36
4.3.5	Diskussion der wiederholten Satzkultivierung	38
4.4	Die Perfusionskultivierungen	39
4.4.1	Die erste Perfusionskultivierung	39
4.4.1.1	Wachstum in der ersten Perfusionskultivierung	39
4.4.1.2	Produktbildung in der ersten Perfusionskultivierung	43
4.4.1.3	Zellrückhaltung und Aggregatbildung in der ersten Perfusionskultivierung	45
4.4.1.4	Substratverbrauch in der ersten Perfusionskultivierung	46
4.4.1.5	Nebenproduktbildung in der ersten Perfusionskultivierung	48
4.4.1.6	Aminosäurekonzentrationen sowie spezifische Aminosäureverbrauchsraten in der ersten Perfusionskultivierung	50
4.4.1.7	Diskussion der ersten Perfusionskultivierung	52
4.4.2	Die zweite Perfusionskultivierung	53
4.4.2.1	Wachstum in der zweiten Perfusionskultivierung	53
4.4.2.2	Produktbildung in der zweiten Perfusionskultivierung	56
4.4.2.3	Zellrückhaltung und Aggregatbildung in der zweiten Perfusions-kultivierung	58
4.4.2.4	Substratverbrauch in der zweiten Perfusionskultivierung	59
4.4.2.5	Nebenproduktbildung in der zweiten Perfusionskultivierung	61
4.4.2.6	Aminosäurekonzentrationen sowie spezifische Aminosäureverbrauchsraten in der zweiten Perfusionskultivierung	63
4.4.2.7	Diskussion der zweiten Perfusionskultivierung	65
4.4.3	Die dritte Perfusionskultivierung	66
4.4.3.1	Wachstum in der dritten Perfusionskultivierung	66
4.4.3.2	Produktbildung in der dritten Perfusionskultivierung	69
4.4.3.3	Zellrückhaltung und Aggregatbildung in der dritten Perfusionskultivierung	71
4.4.3.4	Substratverbrauch in der dritten Perfusionskultivierung	72
4.4.3.5	Nebenproduktbildung in der dritten Perfusionskultivierung	74
4.4.3.6	Aminosäurekonzentrationen sowie spezifische Aminosäureverbrauchsraten in der dritten Perfusionskultivierung	76
4.4.3.7	Diskussion der dritten Perfusionskultivierung	78
4.5	Vergleich der Bioreaktorkultivierungen	79
5	Zusammenfassung und Ausblick	82
6.	Anhang	85
6.1	Literaturverzeichnis	85
6.2	Abkürzungsverzeichnis	90
6.3	Verzeichnis der Symbole und Indizes	91
6.4	Abbildungsverzeichnis	93

Textprobe:

Kapitel 3.2, Die Zellkulturmedien:

Für die T-Flaschen-, Spinner-, Superspinner- und Satzkultivierungen wurden unter anderem die Flüssigmedien ProCHO 4 und ProCHO 5 (Cambrex, Baltimore, USA) benutzt. Diese Medien sind bis auf Insulin, bei dessen Herstellung tierische Substanzen verwendet werden, frei von ani-malischen Komponenten. Sie sind chemisch nicht definiert, da sie Sojahydrolysat enthalten und weisen Glucosekonzentrationen von 22,2 mM (ProCHO 4) und 45,5 mM (ProCHO 5) auf. Die Fermentationsmedien wurden vor Gebrauch auf eine Glutaminkonzentration von 4 mM eingestellt.

Für die Superspinner und Satzkultivierungen wurde weiterhin das Medium MAM-PF 2 (Amimed AG, Basel, Schweiz) im Verhältnis MAM-PF 2 : ProCHO = 21:1 eingesetzt. MAM-PF 2 ist ein proteinfreies Medium und enthält in etwa viermal so hohe Aminosäurekonzentrationen wie herkömmliches DMEM/F12-Medium. Es hat ferner eine Glucosekonzentration von 24,0 mM und enthält 0,1% Pluronic F68. Das Medium wurde ebenfalls vor Gebrauch auf eine Glutamin-konzentration von 4 mM eingestellt.

In den Vorkulturen, also T-Flaschen, Spinnern und Superspinnern, wurde ferner Methotrexat in einer Konzentration von 1,0 µM zur Stabilisierung der hGH-Genkassette eingesetzt.

Für die Perfusionskulturen wurde eine Mediummischung von MAM-PF 2 und ProCHO im Verhältnis 11:1, 21:1 bzw. 41:1 eingesetzt, die auf 4 mM Glutamin eingestellt war.

3.3, Vorgehensweise:

Nach Erhalt des Kryoröhrchens und der mit Zellsuspension gefüllten T25-Flasche wurden die Zellen in weiteren T25-, T75 und T175-Flaschen passagiert und hierbei verschiedene Medien getestet. Daraufhin wurden die Kultivierungen in ungeregelten, gerührten Systemen, den Spinnern und Superspinnern durchgeführt und ebenfalls mehrere Medien ausprobiert. Danach wurden Versuche im 2 Liter Satzbioreaktor und im 2 Liter Perfusionsbioreaktor gefahren, wobei im 2 Liter Satzbioreaktor ebenfalls unterschiedliche Nährmedien getestet wurden.

3.4, Die Kultivierungsysteme:

3.4.1, Die T-Flaschen:

Zur Vorkulturführung wurden die Zellen in T25,- T75- und T175-Flaschen kultiviert. In den T25-Flaschen wurde neben dem ProCHO 4-Medium auch reines MAM-PF 2-Medium und DMEM/F12-Medium getestet.

Die Zellen wurden mit einer Zelldichte von 2,0-2,5*105 Zellen/mL eingesät und nach einer Kultivierungszeit von 5 bis 6 Tagen bei einer durchschnittlichen Zelldichte von 1,0-1,4*106 Zellen/mL passagiert.

3.4.2, Die Spinner:

Zu Beginn der Arbeit wurden für die Kultivierungen Spinner (Techne Corporation, Minneapolis, USA; Schott AG, Jena; Integra Biosciences, Chur, Schweiz) mit einem Arbeitsvolumen von 60 und 125 mL und einem Füllvolumen von 250 und 500 mL eingesetzt. Die Spinner besaßen Stab- sowie Paddelrührer und wurden mit einer Drehzahl von 50 Upm gerührt. Es wurden in den Spinnern das Medium ProCHO 4 getestet.

3.4.3, Der Superspinner:

Für die Vorkultur der Bioreaktorversuche wurden 0,5 Liter Superspinner verwendet (Abb. 8). Das Arbeitsvolumen hierbei betrug 500 mL. Der Superspinner ist ein Kultivierungssytem [Lehmann et al., 1992], mit dem größere Volumina als mit herkömmlichen Spinnern aufgrund der Volumenbegasung eingesetzt werden können. Die Besonderheit des Superspinners ist seine blasenfreie Membranbegasung. Hierbei wird eine Silikonmembran aus Accurel auf ein Gestänge gewickelt, in dem sich ein Magnet befindet. Nach Positionierung des Superspinners auf einem Magnetrührer rotiert der Taumelrührer im Kulturgefäß und ermöglicht somit eine Durchmischung und blasenfreie Begasung der Kulturbrühe. Der Superspinner ist an eine Gasversorgung angeschlossen und wird mit 5% CO2 begast. Er wird in einem Brutraum bei einer Temperatur von 37 °C betrieben.