Präparation und Charakterisierung von klonalen, neuralen Zelllinien, welche das EGFP-Tau-Fusions-Protein stabil exprimieren

2 Immunfluoreszenzmikroskopische Untersuchungen der Subklonierungskulturen Die in der Dauerkultur beobachteten geringen Anteile der Zellen, welche das EGFP-TauFusionskonstrukt exprimieren, könnten darauf hindeuten, dass es sich bei den Proben um ein Gemisch von unterschiedlichen Zellen handelt, von denen nur einige in der Lage sind, das Fusionskonstrukt zu exprimieren. Um dies sicher ausschließen zu können, waren Subklonierungsexperimente notwendig. Dabei sollte durch eine Verdünnung der Zellen erreicht werden, dass statistisch nur eine Zelle pro „well“ ausplattiert wurde. In den verschiedenen „wells“ sollten dann Klone, also genetisch identische Zellen der Ursprungszelle, kultiviert werden. So sollte erreicht werden, dass der Expressionsgrad im Falle einer positiven Ursprungszelle nahe 100% und im Falle einer negativen Ursprungszelle nahe 0% liegt. Eine nach dem Ausplattieren der Verdünnungen durchgeführte lichtmikroskopische Kontrolle zeigte, dass beim Ausplattieren der adhärenten PC12-Zellen teilweise wells mit mehreren Zellen sowie Zellklumpen oder aber auch nur mit Pufferlösung ohne Zellen befüllt wurden. Die wells mit mehreren Zellen oder Zellklumpen waren für den weiteren Verlauf des Versuchs unbrauchbar, da sie vermutlich immer noch Zellgemische enthielten. Wells mit nur einer einzelnen Zelle konnten jedoch in genügender Zahl gefunden werden. Um in den einzelnen wells eine genügend hohe Zelldichte zu erreichen, war eine mehrwöchige Inkubation notwendig. Nach etwa zwei bis drei Wochen trat in einigen Kulturen leider eine Pilzinfektion auf. Daraufhin wurden zunächst die kontaminierten wells geleert und mit reinem Alkohol gewaschen um eine weitere Verbreitung des Pilzes zu verhindern. Nicht kontaminierte Kulturen wurden präventiv mit einem Fungistatikum („Nystatin“) behandelt, um eine eventuelle Vermehrung einzelner eingeschleppter Pilzsporen zu verhindern. Die schließlich noch verwendbaren Kulturen wurden immunfluoreszenzmikroskopisch auf die Expression von EGFP-Tau untersucht, um den Anteil an positiven Zellen zu ermitteln. Die dazu notwendige Fixierung der Zellen auf Deckgläschen wurden innerhalb eines Tages durchgeführt. Die detaillierten Auszählungsergebnisse sind im Anhang dargestellt, eine zusammenfassende grafische Darstellung findet sich in der Abbildung 3.5. [...]

Abbildung 3.4: Relativer Anteil von Zellen, die das EGFP-Tau-Fusionskonstrukt exprimieren. Die Teilabbildungen A-D beziehen sich auf jeweils eine Zelllinie. Säulenförmig dargestellt sind die Auszählungsergebnisse zum jeweiligen Zeitpunkt. Um mögliche Muster besser erkennen zu können, wurden die Messpunkte untereinander verbunden. Teilabbildung E zeigt die Werte für alle untersuchten Zellinien, während Teilabbildung F nur die Verbindungslinien einander gegenüberstellt. Auffälig ist ein Maximum, welches nach etwas 60 Tagen für die Zelllinien IV C 4, II C 6 und I D2 finden lässt. Für die Zelllinie IV D 2 findet sich dieses Maximum nicht. Daher dürfte es sich hier eher um eine zufällige Konvergenz handeln. [...]

rund 2%. Die Zelllinie mit der höchsten Expressionsrate war die Linie II C 6, für sie konnte ein Mittelwert von etwa 30% ermittelt werden. An dieser Stelle soll nur auf die zusammenfassende Darstellung der Ergebnisse in Abbildung 3.4 eingegangen werden. Dort wird die Entwicklung des Anteils positiver Zellen im Laufe der Zeit dargestellt. Es sind Schwankungen des Expressionsgrades zu erkennen. Ein Muster lässt sich nicht nachweisen. Im Laufe der Zeit scheint der Anteil der positiven Zellen einer Kultur zufällig zu schwanken. Es ist keine Abhängigkeit von der Zeit zu erkennen. Auch ein Vergleich der Stämme untereinander vermag keine Evidenzen für eine Regelmäßigkeit zu liefern. Diese sind von Zelllinie zu Zelllinie unterschiedlich. [...]