Physikalische Kartierung eines Blutdruck-assoziierten Bereiches auf Chromosom 10 der Ratte

Bei einer Elektrophorese mit konstanter Feldstärke und konstantem Feldvektor ist die Mobilität von DNA >30-50 kb nicht mehr von ihrer Größe abhängig (Chu, 1991). Eine Auftrennung ist somit nicht mehr möglich und die DNA wandet im Gel als eine diffuse Bande. Falls die DNA jedoch während der Elektrophorese zum Richtungswechsel gezwungen wird, trennen sich unterschiedlich große Fragment innerhalb dieser Bande. Mit jedem Wechsel der Feldrichtung bewegen sich kleinere DNA-Fragmente schneller in die neue Richtung als größere. Größere DNA-Fragmente bleiben demnach hinter kleineren zurück, was in einer Auftrennung resultiert. Mittels Pulsfeld-Gelelektrophorese lässt sich DNA bis ca. 10 MB auftrennen, zum Vergleich das größte Chromosom von S. cerevisiae hat eine Größe von 2,2 MB (Chu, 1991). Zur Aufreinigung von YAC-DNA wurde hier das CHEF-Verfahren (contour-clamped homogeneous electric fields, Chu 1986) verwendet, das mit einer hexagonalen Elektrodenanordnung und – im Falle des hier benutzten Elektrophoresegeräts - mit einem nicht variablen Feldwinkel von 120° arbeitet. [...]

Da DNA im Megabasen Bereich wie YAC DNA sehr scherempfindlich ist, mußte die YAC DNA Präparation in Agaroseblöcken (Plugs) durchgeführt werden. YACs aus den Klonbanken MPMGy916 und WIBRy933 wurden auf YAC Broth Agarplatten mit 50 µg/ml Ampicillin ausgestrichen und 2 d bei 30 °C inkubiert. Anschließend wurde eine Einzelkolonie in ein 15 ml Röhrchen mit 6 ml YAC Broth überführt und ohne Schütteln 2d bei 30°C inkubiert. Zur Herstellung von Stocks wurden 700µl Hefesuspension mit 300 µl Glycerol gemischt, auf Trockeneis eingefroren und bei –80°C gelagert. Die übrige Zellsuspension wurde 5 min bei 1500 rpm abzentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet in 150 µl Lyticase-Mix resuspendiert. Nach 1h Inkubation bei 25°C wurden 150 µl 2% Lowmelt-Agar in SCE zugegeben und vorsichtig mit der Hefe-Suspension gemischt. Nach Festwerden der Gelblöcke wurden 10 ml NDS-Lösung in jedes Falcon-Tube gegeben und die Tubes 2 d bei 50 °C geschwenkt. Nach Abgießen der NDS-Lösung wurden die Gelblöcke 3x mit TE gewaschen, wobei der TEPuffer zum Inaktivieren der Proteinase K beim zweiten Waschschritt 1 mM PMSF enthielt. Lyticase wurde zum Abbau der Zellwände eingesetzt und ermöglichte die Freisetzung der DNA aus den Zellen, während Proteinase K zum Verdau von Proteinen eingesetzt wurde. 3.1.4 Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) [...]

Genomische DNA wurde aus Nierengewebe des Rattenstammes SHRSP oder SHR mittels Proteinase K Methode mit nachfolgender Chloroform/Phenolextraktion und Ethanolfällung isoliert. Aufgrund der vollständigen Deproteinierung wird mit dieser Methode eine gute DNA Qualität bei hoher Ausbeute erzielt. Nach dem Proteinase K Verdau werden noch vorhandene Proteine durch Phenolisierung entfernt. Phenol ist ein sehr guter WasserstoffBrückenbildner und kann gleichzeitig hydrophobe Wechselwirkungen mit Aminosäureketten ausbilden. So dissoziiert Phenol Protein-Nukeinsäurekomplexe in die freien Komponenten, die Proteine werden denaturiert und reichern sich in der Phenolphase an (Sambrook et al., 2001). Etwa 1g gefrorenes (-80°C) Nierengewebe wurde in einem sterilen Mörser auf Trockeneis in flüssigen Stickstoff zermörsert, in zwei 50 ml Röhrchen gefüllt, 20 ml TEN9 Puffer zugegeben und geschwenkt. 200 µl DNase freie RNase (10mg/ml in H2O) wurden zugegeben und 10 min bei 25°C auf einem Schüttler inkubiert. Zu dem Lysat wurde pro Röhrchen 1 ml Proteinase K (10 mg/ml, in H2O) und 1 ml 20% SDS pipettiert, der Deckel mit Parafilm abgedichtet und 36 h bei 55 °C auf einem Schüttler inkubiert. Nun wurde die DNA wie folgt mit Phenol extrahiert: Zunächst wurden 20 ml Rotiphenol zugegeben, kräftig geschüttelt und zur Phasentrennung 5 min bei 3000 rpm zentrifugiert. Die obere Phase wurde abpipettiert und erneut mit Phenol extrahiert, die untere Phase verworfen. Anschließend wurde die obere Phase mit 20 ml Chloroform/Isoamylalkohol (23:1, v/v) extrahiert und 5 min bei 3000 rpm zentrifugiert. Danach wurde die obere Phase abpipettiert, mit 2 ml 3M Natiumacetat pH=6 und 2,5 Volumen 100% Ethanol versetzt, die Röhrchen leicht geschwenkt und zur vollständigen Ausfällung der DNA ca. 1h bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die DNA war nun als ein weißer Faden sichtbar, der an der Oberfläche schwamm. Mit einer sterilen Pipettenspitze wurde die DNA aus dem Röhrchen entnommen, auf Parafilm abgetropft und in 500 µl TE über Nacht bei 37°C gelöst. 3.1.1 Scheren von genomischer DNA durch Ultraschall [...]