Optimierung und Validierung einer Methode zur Bestimmung von Zearalenon und seinen Metaboliten im Gallensaft von Schweinen mittels LC/MS-MS

Bachelorarbeit von Guido Eckardt

Einleitung:

Ein äußerst ernsthaftes Problem der landwirtschaftlichen Produktion stellt die Kontamination von Futtermitteln mit Mykotoxinen dar. Dabei kann die Gesundheit und vor allem die Leistungsfähigkeit der Nutztiere beeinträchtig sein. Darüber hinaus besteht ebenfalls eine Gefährdung des Menschen durch Aufnahme von mykotixinhaltigen Lebensmitteln tierischer oder pflanzlicher Herkunft. Mykotoxine gewannen in den letzten 15 Jahren ständig an Bedeutung als Ursache für Fortpflanzungsstörungen im Nutztierbestand. Dabei spielen die von Fusarienarten gebildeten Toxine Zearalenon (ZON) und Deoxynivalenol (DON) die größte Rolle. Eine starke Anreicherung und Verbreitung dieser Feldpilze ist die Folge ackerbaulicher Maßnahmen. So wird aus Zeit- und Kostenersparnis eine pfluglose Bodenbearbeitung bevorzugt. Die fehlende Tiefe dieser Bodenbearbeitungsmethode fördert das Pilzwachstum enorm. Weiterhin wird die Entwicklung der Pilze besonders von den klimatischen Bedingungen beeinflusst. Feuchte und warme Sommer sind ideale Voraussetzungen für das Wachstum von Fusarien. Stellen sich allerdings negative Umweltbedingungen ein, beispielsweise niedrige Temperaturen und hohe Niederschlagsraten im Sommer, wird die Toxinproduktion angeregt beziehungsweise gesteigert. 1998 war ein so genanntes Mykotoxinjahr. In Deutschland konnte in diesem Jahr Zearalenon in 74 % der Weizenproben sowie in 95 % der untersuchten Maisproben nachgewiesen werden.

Eine besonders ausgeprägte Empfindlichkeit gegenüber Zearalenon zeigen Schweine. Dabei sind die klinischen Erscheinungen abhängig vom Geschlecht und dem Alter der Tiere. Fütterungsexperimente mit Zearalenon an Schweinen wurden an der Tierklinik der Universität Leipzig (Arbeitsgruppe Dr. Kauffold) in Kooperation mit der Hochschule Anhalt (Arbeitsgruppe Prof. Wähner) durchgeführt. Dabei sollte der Metabolismus von Zearalenon in verschiedenen Matrices der Schweine wie Urin, Gallensaft, Blut und Milch untersucht werden. Der gesamte analytische Teil bzw. die dazu nötigen Untersuchungen zu den Fütterungsexperimenten wurden an der Hochschule Anhalt (FH) im Institute of Bioanalytical Science (IBAS) durchgeführt.

Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Bestimmung von Zearalenon sowie seiner Metabolite Alpha-Zearalenol und Beta-Zearalenol im Gallensaft der Schweine.

Die angewandte bzw. bereits etablierte Standardmethode zur Bestimmung von Zearalenon und seinen Metaboliten der Arbeitsgruppe des IBAS war eine chromatographische Auftrennung mittels einer RP 18-Säule mit anschließender DAD-Detektion. Zur Probenaufarbeitung wurde eine Chem Elut™-Säule (Beladungskapazität: 20 ml) der Firma Varian (Deutschland) verwendet. Es wurde jedoch deutlich, dass diese Methode nicht ausreichend selektiv hinsichtlich der Unterscheidung von Mykotoxinen und Matrixbestandteilen war. Durch die Einführung der Massenspektrometrie am Institut konnten enorme Steigerungen bezüglich der Selektivität und Sensitivität der Methode erreicht werden. Reckin konnte bereits eine optimierte Methode zur Bestimmung von Zearalenon und seinen Metaboliten im Schweineurin mittels LC-MS/MS am IBAS etablieren. Daraus abgeleitet soll die Probenvorbereitung beim Gallensaft optimiert werden.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die bereits bestehende Standardmethode zur Probenaufarbeitung durch Variation bei der Festphasenextraktion zu optimieren. Die dabei untersuchten SPE-Materialien und Methoden wurden hinsichtlich ihrer Effizienz, ihres Zeitbedarfs sowie ihrer Kosten verglichen und bewertet.

Inhaltsverzeichnis:

Textprobe:

Kapitel 2, Theoretische Grundlagen:

Schimmelpilze sind ubiquitär verbreitet und aus evolutionärer Sicht betrachtet – uralt. Das Vorkommen bzw. die Verbreitung der Schimmelpilze kann durch den Mangel an Nährstoffen, durch Anwesenheit von Hemmstoffen sowie konkurrierende Arten eingeschränkt werden. Es wird angenommen, dass selbst der Untergang so genannter Hochkulturen (Azteken, Pharaonendynastien) auf Schimmelpilzkontaminationen – somit auch Mykotoxin-Kontaminationen – zurückzuführen sei. Schon im Mittelalter erkannte man, dass ein Zusammenhang zwischen verzehrtem Brot, welches aus kontaminiertem Getreide hergestellt wurde, sowie epidemieartig auftretenden Erscheinungen einer Intoxikation bestehen muss. Diese Symptomatik, das so genannte ‘heilige Feuer’, wurde zu späterer Zeit als St. Antonius-Feuer bezeichnet. Der Anlass zu intensiveren Forschungen hinsichtlich der Mykotoxine waren Berichte über Vergiftungserscheinungen bei Haustieren zu Beginn des 20. Jahrhunderts. Diese Intoxikationen wurden hauptsächlich durch verschimmeltes Futter sowie durch Mutterkorn hervorgerufen. 1945 ist die Alimentäre Toxische Aleukie (ATA, durch Ernährung bedingte Agranulozytose; Erkrankung des Blutbildungssystems mit schwerer Anämie) in Russland beschrieben worden. Die ATA war durch den hohen Befall des Getreides mit Fusarium hervorgerufen worden. Das Korn konnte durch die Kriegswirren nicht geerntet werden, verblieb somit schneebedeckt auf dem Feld und bot dem Mikroorganismus perfekte Lebensbedingungen. Das stark kontaminierte Getreide wurde zu späterer Zeit geerntet und verarbeitet. Ein weiterer Fall ereignete sich 1960 in England (tukey – X – disease). Hier starben 100.000 Truthühner nach der Aufnahme von aflatoxinhaltigem Erdnussmehl aus Brasilien. Schimmelpilze haben aber auch eine positive Seite. Seit Jahrtausenden bedient mansich ihrer zur Herstellung von Käse oder anderen Lebensmitteln. In jüngerer Zeit nutzt man sie zur Herstellung von Antibiotika (Penicillin aus Penicillium spp.) bzw. verändert sie genetisch zur Produktion von Enzymen. Mykotoxine sind sekundäre Stoffwechselprodukte der Schimmelpilze. Die Tatsache, dass diese Metabolite nicht bei allen Organismen zu finden sind, macht diese zu sekundären Stoffwechselprodukten. Neben den Antibiotika sind Mykotoxine die zweite große Wirkstoffgruppe, die von Schimmelpilzen synthetisiert werden. Derzeitig sind über 300 Mykotoxine beschrieben worden, die von mehr als 250 Pilzarten gebildet werden. Die von Basidiomyceten gebildeten Giftstoffe (Bsp.: Amanitin des Knollenblätterpilzes), werden nicht den Mykotoxinen im klassischen Sinn zugeordnet.

Die Mykotoxine bilden aufgrund ihrer sehr unterschiedlichen chemischen Strukturen eine äußerst heterogene Stoffgruppe. Sie treten beispielsweise als Alkaloide, Säuren oder Lactone auf. Eine gewisse Systematik stellt jedoch die Einteilung nach dem Bildungsort (auf dem Feld, während der Lagerung) bzw. der Bildungszeit (vor der Ernte, nach der Ernte) dar. Die Wirkung kann akut oder chronisch sein. Akute Vergiftungserscheinungen äußern sich in Schädigungen der Niere, der Leber, der Haut, der Schleimhäute (bevorzugt im Gastrointestinaltrakt), des Immunsystems sowie des ZNS. Folgen durch chronische Vergiftungen sind Krebs, Schädigung der DNA, Missbildungen sowie Aborte. Allergene Effekte sowie eine Photosensibilität der Haut werden beschrieben. Von der teilweise hochgradigen Toxizität der Schimmelpilzgifte sind Menschen, Tiere aber auch Pflanzen und andere Mikroorganismen betroffen. Als Grund für die Bildung der Mykotoxine werden zwei Argumente diskutiert. Einerseits sollen sie vor Fressfeinden (Tiere) oder Nahrungskonkurrenten (Pflanzen und Tiere) schützen, andererseits können Mykotoxine auch zur Verteidigung des eigenen Lebensraums aufgefasst werden. Mykotoxin bildende Schimmelpilze befallen vorrangig pflanzliche Nahrungs- bzw. Futtermittel. Entsprechend sind sie eine der häufigsten Ursachen von Lebensmittel und Futtermittelvergiftungen. Für die Kontamination von Nahrungsmitteln lassen sich drei Möglichkeiten unterscheiden. der Primärkontamination werden befallene – dadurch auch toxinhaltige – Lebensmittelrohstoffe weiterverarbeitet. Durch Zerkleinerung des Pilzmycels ist das Erkennen eines Befalls durch den Verbraucher äußerst schwierig. Hauptvertreter sind hierbei die sog. Feld- bzw. Lagerpilze.

Bei der Sekundärkontamination ist dem Verbraucher die Möglichkeit gegeben, den Befall zu erkennen. Die Pilze bilden entsprechend sichtbare Kolonien aus und die Lebensmittel- bzw. Futtermittel werden somit kontaminiert. Die dritte Möglichkeit bei der Kontamination ist der sog. carry over – Effekt. Dabei nehmen Nutztiere kontaminierte Futtermittel auf. Die Toxine können dabei via Kumulation in entsprechenden Organen bzw. Geweben in originärer Form sowie in metabolisierter Form abgelagert (Fleisch, Ei), aber auch ausgeschieden werden (Milch). Eine Kontamination mit Mykotoxinen ist beim carry over – Effekt äußerlich nicht zu erkennen.

Die Mykotoxine haben eine ausgeprägte Stabilität gegenüber Hitze, Säuren und Alkalien. Diese Eigenschaft macht sie zu einer potenten Gefahr, sowohl im landwirtschaftlichen Bereich als auch auf dem Nahrungsmittelsektor. Stark kontaminierte Chargen (beim Überschreiten der vorgeschriebenen Grenz- bzw. Richtwerte) dürfen keiner Weiterverwertung zugeführt werden. Dementsprechend können Mykotoxine zu beträchtlichen Schäden aus betriebs- und volkswirtschaftlicher Sicht führen. Ein Verschneiden von leicht kontaminierten Chargen mit ‘sauberen’ Chargen stellt eine Möglichkeit dar, um dennoch wirtschaftlichen Nutzen ziehen zu können. Der Einsatz adsorptiv wirkender Detoxifikationsmittel wird kontrovers diskutiert.