Optimierung der Produktion und Aufarbeitung von Glucose-6-phosphat Dehydrogenase und Hexokinase aus Bäckerhefe

Abbildung 24 : Verlauf der Glucose- und Trockenbiomassekonzentrationen der ersten Satz-Kultivierung, Arbeitsvolumen: 2 Liter, (Vorkultur: 2 mal 100 ml Nährlösung mit je 5,7 g Presshefe, Mittelwert der TBM nach Vorkultivierung: 12,9 g/l) Die Glucosekonzentrationen der Kulturbrühe sanken während der Kultivierung kontinuierlich von 30 g/l bis 0 g/l innerhalb von 4,5 Stunden. Der Graph der Trockenbiomassekonzentrationen zeigt ein typisches diauxisches Verhalten. Nach 30 min wurde die erste Trockenbiomassekonzentration bestimmt. Der Mikroorganismus befand sich von t = 0,5-2 Stunden in der Beschleunigungsphase (Akzelerationsphase), in der die Trockenbiomassekonzentrationen leicht zunahmen. Danach ging das Wachstum in die exponentielle Phase im Zeitraum t = 2-3,5 Stunden über, in der die Konzentrationen der Hefetrockenbiomasse exponentiell stiegen. Nun schloss sich eine Verzögerungsphase an, in der die Glucose limitierend wirkte (t = 3,5-4,5 Stunden). Nachdem die Glucose verbraucht war, folgte eine diauxische Übergangsphase vom Zeitpunkt t = 4,5-5 Stunden, in der der Mikroorganismus seinen Enzymapparat vermutlich auf Ethanol als Substrat umstellte (Die Ethanolkonzentrationen konnten während dieser Kultivierung nicht gemessen werden). Nun war das Wachstum nur gering. Dann schlossen sich wiederum eine exponentielle Phase (t = 5-6 Stunden) und eine Verzögerungsphase (t = 6-7 Stunden), in der Ethanol vermutlich limitierend wirkte, an. Schließlich [...]

Für die Kultivierungen wurden 3 verschiedene Prozessführungen (Satz-, Satz-Betriebsweise mit impulsweiser Zufütterung und kontinuierliche Betriebsweise) gewählt. Die Satz-Kultivierungen (Satz-1, Satz-2) und Satz-Kultivierungen mit impulsweiser Zufütterung (IZ-Satz-1, IZ-Satz-2) wurden hinsichtlich ihrer Reproduzierbarkeit überprüft. Satz-1 und Satz-2 wurden durchgeführt, um mit dem Zellkulturprozess und der damit verbundenen Trockenbiomasse- und Glucoseanalytik vertraut zu werden. IZ-Satz-1 und IZSatz-2 wurden gewählt, um eine Trockenbiomassekonzentration von 10 g/l auf Glucose als Substrat zu erreichen und festzustellen in welcher Phase des Bioprozesses die Bildung an G6P-DH am größten ist. Weiterhin folgten eine Zulauf-Satz-Kultivierung mit nachfolgender kontinuierlicher Prozessführung (IZSatz-Konti), um eine höhere Biomasseausbeute zu erreichen und um die Satz- und kontinuierliche Kultivierung miteinander zu verbinden. Den Studenten soll im Praktikum auch eine kontinuierliche Kultivierung vermittelt werden. Ferner sollte genügend Biomasse erzielt werden, um mit dem daraus gewonnenen Enzymen einen Glucosetest durchführen zu können. Abschließend folgte eine kontinuierliche Kultivierung (Konti-1) bei der untersucht werden sollte, ob sich bei einer Glucosekonzentration unter 10 g/l zu bestimmten Zeitpunkten erhöhte Enzymaktivitäten/TBM einstellten. [...]

4.12 Bestimmung der volumenbezogenen Enzymaktivität von G6P-DH während der Kultivierung Während der Kultivierung wurden nur die volumenbezogenen Aktivitäten von G6P-DH gemessen. Um herauszufinden, in welchem Abschnitt der Kultivierung die Produktion von G6P-DH am größten ist und zu ermitteln, ob es wachstumsgekoppelt gebildet wird, wurde bei den Satz-Kultivierungen mit impulsweiser Zufütterung, der Zulauf-Satz-Kultivierung mit anschließender kontinuierlicher Prozessführung und der kontinuierlichen Kultivierung in Abständen von 30 min 20 ml Probe entnommen und diese mit einer Vakuumpumpe der Firma Knf Neuberger Laboport abfiltriert. Hierbei wurden Filter mit einer Porengröße von 0,45 µm und einem Durchmesser von 50 mm der Firma Schleicher und Schuell verwendet. Danach wurde der Filterkuchen vom Membranfilter abgeschabt und mit Sand der 1,5 fachen Menge an Feuchtbiomasse mit Mörser und Pistill 5 min lang aufgeschlossen. Anschließend wurde 1 ml NaH2PO4Puffer hinzugegeben und der Sand sowie die Hefezellbruchstücke in einem Eppendorfhütchen mit der Zentrifuge Centrifuge 5415 C der Firma Eppendorf bei einer Rotationsgeschwindigkeit von 7000 min-1 5 min lang von der Proteinlösung abzentrifugiert. Abschließend wurde die abzentrifugierte Enzymlösung mit Pellet im Kühlschrank bei +4 °C gelagert und einen Tag nach der Kultivierung ein Enzymtest zur Ermittlung der volumenbezogenen Enzymaktivität von G6P-DH durchgeführt. 4.13 Bestimmung der Proteinkonzentrationen des Rohextraktes und eluierter Fraktionen mit Bradford-Reagenz Zur Bestimmung der Proteinkonzentration und damit der Enzymaktivität/Gesamtproteinmenge des Rohextraktes und ausgewählter Fraktionen wurde Bradford-Reagenz verwendet. Bradford-Lösung enthält Coomassie brilliant blue G-250, welches bei einer Bindung an Proteine zu einer Blaufärbung der Lösung führt und das Absorptionsmaximum von 465 nm ohne Protein zu 595 nm mit Protein verschiebt. Durch die Zunahme der Absorption bei 595 nm kann mit Hilfe eines Spektralphotometers mittels einer Kalibriergeraden die Proteinkonzentration einer unbekannten Proteinlösung bestimmt werden. In dieser Diplomarbeit wurde mit den Albuminproteinkonzentrationen 0,1 g/l, 0,3 g/l, 0,5 g/l, 0,8 g/l und 1 g/l eine Kalibriergerade erstellt. Dabei wurden die Extinktionen bei einer Wellenlänge von 595 nm mit dem selben Spektralphotometer, das für den Enzymtest verwendet wurde, gemessen. Anhand der folgenden Gleichung, die die Abhängigkeit von der Proteinkonzentration zur Extinktion angibt, konnte eine unbekannte Proteinkonzentration ermittelt werden (Abbildung 23): c(Proteinlösung) = 1,306 * ∆E [g/l] [32] [...]