Mutationsanalyse und Grundlagen für funktionale Untersuchungen zu den positionalen Kandidatengenen für katatone Schizophrenie, EIF2AK4 und SLC12A6, aus der chromosomalen Region 15q14-15

6.1.2 Sequenzierergebnisse Es konnten einige Besonderheiten in Promotor, Exon 1-3 und Exon 10 festgestellt werden. Für Exon 4 wurden keine Abweichungen von der Datenbank des menschlichen Genoms dokumentiert. Die folgenden Nukleotidposition-Bezeichnungen sind der Sequenz des „Human Genome Projects“ entnommen und beziehen sich auf die Version UCSC Genome Browser Human April 2003 Freeze. Das Gen GCN2/EIF2AK4 befindet sich auf Chromosom 15q15.1 und umfasst die Nukleotidpositionen nt 37825253-37906929. a) Promotor: Die Kontrollperson TK66 besitzt im Promotor bei nt 37805432 eine heterozygote A/A => A/G Variante. Auf dem Reverse- Ergebnis ist ein Cytosin angegeben, man erkennt jedoch deutlich das gleichzeitige Vorhandensein des Peaks für Thymin (siehe Abb.18 und 19). [...]

6. Ergebnisse 6.1 Ergebnisse der Mutationsanalyse des Gens GCN2 durch automatisierte Sequenzierung Wie bereits ausführlich dargestellt wurde, gehört GCN2 zu den wohl wichtigsten Kandidatengenen für Chromosom15- bezogene Schizophrenie (SCZD10) in den von unserer Gruppe untersuchten Familien. Es liegt in der Region 15q14-15 und wird von drei der in unserer Gruppe untersuchten Familien unterstützt. GCN2 ist eines von nur 90 Genen, welche durch die Moises-Hypothese als Kandidatengene für Schizophrenie vorgeschlagen werden. Es hat eine wichtige Funktion in Translationsprozessen, so dass unter anderem die Hypothese unterstützt wird, ein Defizit in der cerebralen Proteinsyntheserate könne Schizophrenie hervorrufen. Um die Frage zu klären, ob Veränderungen in GCN2 mit dem Auftreten katatoner Schizophrenie kosegregieren, wurden für diese Arbeit sowohl Promotorregion als auch Exons 1-4 sowie Exon 10 des Gens dreier Patienten und zwei Kontrollindividuen sequenziert und miteinander verglichen. Zunächst wurden die Regionen von Interesse durch Polymerase–Kettenreaktion amplifiziert, gereinigt und die Reinheit der Produkte durch elektrophoretische Auftrennung überprüft. Anschließend wurden bei der Sequenzierreaktion die PCR Fragmente unter Verwendung fluoreszierender Nukleotide neusynthetisiert und abermals gereinigt. Der Sequenzierer detektiert diese Reste und differenziert sie in einer einzigen Laufspur auf dem Sequenziergel. Man erwartet, eine Reihe von Varianten zu finden. Sollten einige davon in der DNA der untersuchten Patienten, nicht aber bei den gesunden Kontrollen zu finden sein, müssen diese in einer größeren Stichprobe genauer untersucht werden. 6.1.1 Überprüfung der Reinheit der PCR-Produkte Wie bereits unter Methoden beschrieben, wurden für die PCR Ansätze im Allgemeinen Standardbedingungen eingehalten. Standardmäßig beinhaltete ein Reaktionsansatz (25 µl Endvolumen) 10pmol je Oligonukleotid, 40-60ng genomische DNA, 2,5mM jedes NTPs, 2,5µl eines 10x Puffers (Besonderheit nur bei Goldstar System) und etwa 1U Taq Polymerase. 49 [...]

Auch dieses Versuchsprotokoll wurde in der Vergangenheit dazu verwendet, eine große Stichprobe für die distale Variante zu genotypisieren. 5.3.6 Vorbereitung des Sequenzier-Auftrages an MWG-Biotech Pro ausgewählten Klon wurden 60 µl der Bakterienkultur in einen 500 ml Kolben mit 50 ml LB Medium und 60 µl Ampicillin (50 mg/ml) gegeben. Das Gemisch ließ man über Nacht in einem Wasserbad bei 37°C sanft schütteln, damit sich die Bakterien vermehren konnten. 900 µl der Übernachtkultur wurde für spätere Verwendung mit 100 µl 10x Freezing Medium vermischt und sofort bei -70°C gelagert. Die übrigen Bakterien wurden bei 4000 rpm herunterzentrifugiert und das Pellet gemäß Protokoll des verwendeten QIAfilter Plasmid Midi Kits (Qiagen, Hilden) weiterverarbeitet. Für die genaue Beschreibung der Methode siehe Originalprotokoll. 15 µg der luftgetrockneten Plasmid DNA wurden zur Sequenzierung durch Primer-walking Technik (99% Lesegenauigkeit) an MWG Biosciences, Ebersberg, weitergeschickt. 5.3.7 Überprüfung der Segregation der oberen G-Variante in Familie 11 Zur Überprüfung der oberen G-Variante in Familie 11 wurde unter exakt den gleichen Bedingungen gearbeitet wie zuvor. Zunächst wurden in einer Standard PCR die 424 bp großen Promotor-Fragmente amplifiziert. Dafür wurde das Oligonukleotidpaar VP-Prom1-1F und VP-Prom1-1R verwendet. Für den Schnitt wurden etwa 12,5 µl PCR Produkt, 1 µl (10 U) Enzym und 1,5 µl 10x NE Puffer1 in einem Endvolumen von 15 µl für 1,5 Stunden bei 37°C inkubiert. Als Trennmedium in der anschließenden Elektrophorese diente 2% Agarosegel; die Färbung erfolgt wie immer mit Ethidiumbromid. Das Ergebnis wurde mit den Daten aus der Genotypisierung anhand eines Stammbaumes verglichen. [...]