Methodische Arbeiten zur Entwicklung verbesserter Enzymaktivitätsbestimmungen von Xylanasen und Glucanasen in komplexen Proben (Futtermitteln und Digesta)

Dissertation / Doktorarbeit von Matthias Froeck

Problemstellung:

In der Tiernährung werden verschiedene Enzyme eingesetzt, um bei landwirtschaftlichen Nutztieren antinutritive Effekte pflanzlicher Futtermittel zu beseitigen und die Futterverwertung zu verbessern. Nichtstärkepolysaccaride abbauende Enzyme unterstützen die Verdauungskapazität körpereigener Enzyme, indem viskositätsbildende Futterkomponenten für die das Tier keine eigenen Enzyme besitzt, partitiell hydrolysiert werden, und durch körpereigene Enzyme verdauliche Nahrungsbestandteile auf Grund einer Solubilisierung von Zellwandkomponenten dem enzymatischen Abbau besser zugänglich gemacht werden. So senken Xylanasen und ß-Glucanasen die Viskosität des Nahrungsbreis im Verdauungstrakt und fördern dadurch die Verdaulichkeit der Hauptnährstoffe z.B., bei Broilern.

Kommerzielle Nichtstärkepolysaccharide spaltende Enzyme werden meist durch Fermentationsprozesse mit Pilzen hergestellt. Der Einschluss NSP-spaltender Enzyme in die EU-Futterzusatzstoffdirektive hat folgende Forderung an die Enzymanaltytik gestellt: da die Enzyme in den Beschreibungen der Futtermittel als Zusatzstoffe deklariert werden müssen, verlangen die zuständigen Behörden eine Testmethode zur Enzymaktivitätsbestimmung im Futtermittel, damit die beigemengten Enzyme tatsächlich den Konzentrationen entsprechen, die in Produktspezifikation angegeben sind.

Das geltende Futtermittelrecht fasst alle Wirkstoffe unter dem Begriff Futterzusatzstoffe zusammen. Juristisch gelten für Enzyme in Futtermitteln die gleichen Anforderungen, wie sie an andere Futterzusatzstoffe gestellt werden. Ihre Unbedenklichkeit für das Tier und den Menschen als Endverbraucher muß gesichert, die Wirksamkeit erwiesen und die Kontrollierbarkeit gewährleistet sein.

Um die Kontrollierbarkeit und die Wirksamkeit zu gewährleisten ist es notwendig, die Aktivitätsbestimmung von Enzymen in komplexen Proben mit einfachen, aber exakten Methoden weiter zu optimieren.

Inhaltsverzeichnis:

1.	Einleitung	1
2.	Problemstellung	2
3.	Grundlagen	4
3.1	NSP–hydrolysierende Enzyme, die als Futterzusatzstoffe von Bedeutung sind	4
3.2	Substrate zur Enzymaktivitätsbestimmung	5
3.2.1	Xylane	5
3.2.2	b–Glucane	6
3.3	Futtermittel	7
3.4	Literaturübersicht	7
3.4.1	Häufig angewendete Methoden in der Enzymanalytik	7
3.4.2	Verwendung modifizierter Substrate	10
4.	Materialien, Methoden und Versuchsdurchführung	15
4.1	Charakterisierung der Enzyme	15
4.1.1	Extraktionsmethode	15
4.1.2	Proteinbestimmung	15
4.1.3	Enzymaktivität über die Bildung von Reduktionsäquivalenten	15
4.1.4	Enzymreinigung	16
4.1.5	Bestimmung der Molmassen und Verteilung der aktiven Komponenten mit Hilfe der Gelelektrophorese	17
4.1.6	Bestimmung der pH–Optima	17
4.1.7	Temperaturverhalten der Enzympräparate	18
4.1.8	Bestimmung der isoelektrischen Punkte	18
4.1.9	Bestimmung der Hydrolysemuster mittels HPLC	18
4.2	Aktivitätsbestimmung in komplexen Medien	19
4.2.1	Verdünnung der Enzymlösungen	19
4.2.2	Agardiffusionstest	19
4.2.3	Viskositätsmessung	20
4.2.4	Chromogene Substrate	21
4.2.4.1	Substrate mit Reaktivfarbstoffen	22
4.2.4.2	Substrate mit ionischen Farbstoffen	23
4.2.4.3	Substrat mit kationischem Farbstoff (Rutheniumrot)	23
4.2.5	Farbreaktionsmethode	23
4.3	Substratmodifikationen	24
4.3.1	Physikalische Substratmodifikation	24
4.3.2	Chemische Substratmodifikation	25
4.3.2.1	Löslichkeitsverbesserung	25
4.3.2.2	Farbstoffkopplung	27
4.3.3	Enzymatische Substratmodifikation	31
4.3.4	Substratcharakterisierung	32
4.3.5	Futtermittel	33
4.4	Enzymbestimmung durch Farbreaktion	36
5.	Ergebnisse	37
5.1	Enzymcharakterisierung	37
5.1.1	Biochemische Charakterisierung	37
5.1.2	Hydrolysemuster der verschiedenen Enzympräparate	42
5.2	Enzymaktivitätsbestimmung in komplexen Medien	46
5.2.1	Agardiffusionstest	46
5.2.1.1	Xylanase–Aktivitätsbestimmung	47
5.2.1.2	Bestimmung derb–Glucanaseaktivität	63
5.2.2	Bestimmung der Enzymaktivität auf Basis der Viskositätsabnahme	66
5.2.3	Enzymaktivitätsbestimmung mit chromogenen Substraten	72
5.2.3.1	Vergleich der chromogenen Substrate	90
5.3	Farbreaktion — Methodenentwicklung und Anwendung	91
5.4	Substratmodifikation	97
5.4.1	Physikalische Substratmodifikation	97
5.4.2	Chemische Modifikation	98
5.4.2.1	Saure bzw. basische Behandlung	98
5.4.2.2	Acetylierung	98
5.4.3	Enzymatische Modifikation	98
5.5	Substratcharakterisierung	98
5.6	Einfluß des Futtermittels auf die Enzymaktivitätsbestimmung	103
5.7	Zusammenfassung der Ergebnisse	105
6.	Diskussion	109
7.	Zusammenfassung	121
8.	Abstract	124
9.	Anhang	127
9.1	Puffer und Reagenzien	127
9.2	Produktbeschreibung Haferspelzenxylan	130
9.3	Gradienten–Programm der HPLC	130
10.	Literatur	131
11.	Danksagung	139
12.	Lebenslauf	141