Kontinuierliches Monitoring von Glukose, Laktat und Ammonium mit 'Bioanalytischen Mikrosystemen'

Dissertation / Doktorarbeit von Barbara Enderle

Einleitung:

Biochemische Parameter für die Diagnose physiologischer Abnormitäten werden normalerweise in diskreten Proben analysiert, wobei die biochemische Analyse gewöhnlich in medizinischen Laboren mit spezifischen, meist sehr teuren Geräten durchgeführt wird.

Hierbei geht vom Zeitpunkt der Probennahme bis zum Vorliegen des Untersuchungsergebnisses für Mediziner und Patienten oft wertvolle Zeit verloren. Außerdem können lange Standzeiten der Proben das Ergebnis verfälschen.

Die Entwicklung von Analysemethoden, die ein kontinuierliches Monitoring von Körperflüssigkeiten in der Klinik oder zu Hause ermöglichen, ist daher von großem Interesse für die klinische Diagnostik. Sie ermöglichen die Erfassung von Messwert-Änderungen innerhalb kurzer Zeitintervalle, die bei der Gewinnung diskreter Proben übersehen werden könnten.

Der Einsatz von Biosensoren, gekoppelt mit einem miniaturisierten, kontinuierlichen Probennahme-System liefert realisierbare und kostengünstige Voraussetzungen für ein reproduzierbares „on-line-bedside“ Analyse-System.

Inhaltsverzeichnis:

1.	Einleitung	1
1.1	Biosensoren	1
1.2	Monitoring-Systeme zur Bestimmung metabolischer Stoffwechsel-Parameter	5
1.3	Stand der Technik	5
1.3.1	Implantation von Biosensoren	5
1.3.2	Kontinuierliche Probennahme-Systeme	6
1.4	Anwendungsbereiche der Mikrodialyse	9
1.5	In-vivo Recovery unter Anwendung der Mikrodialyse	10
1.5.1	No-net-flux-Methode	10
1.5.2	Zero-flow-Methode,	11
1.5.3	Near-Equilibrium-Dialyse	11
1.6	Diabetes mellitus	12
1.6.1	Der Typ I Diabetes	12
1.6.2	Der Typ II Diabetes	12
1.6.3	Komplikationen und Spätfolgen des Diabetes mellitus	13
1.7	Hyperammonämie	14
1.7.1	Harnstoffzyklus	14
1.8	Ziel der Arbeit	16
2.	Monitoring von Glukose und Laktat im subkutanen Gewebe	18
2.1	Material	19
2.1.1	Chemikalien	19
2.1.2	Pufferlösungen	19
2.1.3	Geräte	20
2.1.4	Verbrauchsmaterial	20
2.2	Methoden	21
2.2.1	Bioanalytisches Mikrosystem	21
2.2.2	Mikrodialyse	28
2.2.3	Kombination der Mikrodialyse mit dem „Bioanalytischen Mikrosystem“	29
2.2.4	Referenzmessung mit dem CMA-600-Analysator	30
2.2.5	Bestimmung des technischen Delays der Glukose- und Laktatmessung	32
2.2.6	Bestimmung der Wiederfindungsrate des Analyten (Recovery) unter Einsatz des CMA-70 Mikrodialyse-Katheters	33
2.2.7	Monitoring von Glukose- und Laktat im subkutanen Gewebe und Bestimmung der Plasmawerte	35
3.	Ergebnisse	37
3.1	Kalibration der Sensoren	37
3.2	Bestimmung des technischen Delays für Glukose und Laktat	39
3.2.1	Berechnung des technischen Delays der Sensorergebnisse	39
3.2.2	Berechnung des technischen Delays der CMA-Ergebnisse	40
3.2.3	Experimentelle Bestimmung des technischen Delays der Sensordaten	41
3.3	Bestimmung der relativen Recovery	42
3.3.1	Relative Recovery in-vitro in Abhängigkeit von der Flussrate	42
3.3.2	Relative Recovery in-vitro bei konstanter Flussrate	43
3.3.3	Bestimmung der in-vivo Recovery mit der „zero-flow-Methode“	45
3.4	Bestimmung von Glukose im subkutanen Gewebe und im Plasma	47
3.4.1	Physiologisches Delay der Glukosemessung im subkutanen Gewebe	47
3.4.2	Relative Recovery der mit dem Sensor ermittelten Glukosewerte im subkutanen Gewebe bezogen auf die Plasma-Glukose-Werte	48
3.4.3	Kinetik der Plasmawerte im Vergleich zu den Sensor Ergebnissen	49
3.4.4	Quotient Plasmaglukose zu Glukose im subkutanen Gewebe	50
3.4.5	Korrelation der relativen Recovery mit dem BMI der Probanden	50
3.5	Simultane Bestimmung von Glukose und Laktat im subkutanen Gewebe	51
3.5.1	Korrelation der Sensorergebnissen mit den Plasmawerten	52
3.5.2	Korrelation der Sensorergebnisse mit der Referenzmethode	53
3.6	Vergleich der Glukosemessung abdominal und antebrachial	55
3.6.1	In-vitro Assay zur Untersuchung der Fluidikprobleme bei Messungen von Glukose im subkutanen antebrachialen Gewebe	56
4.	Diskussion	58
5.	Etablierung einer non-invasiven Ammoniakmessung im Speichel und dessen Bestimmung mit einem Glutamatsensor	63
5.1	Material	66
5.1.1	Chemikalien	66
5.1.2	Pufferlösungen	67
5.1.3	Geräte	68
5.1.4	Verbrauchsmaterial	68
5.2	Methoden	69
5.2.1	Amperometrische Bestimmung von Ammonium mit dem Glutamatsensor	69
5.2.2	Ammonium-Assay	70
5.2.3	Absorptionsspektrum des Co-Enzyms NADPH	71
5.2.4	Evaluierung des Ammonium-Assays mit dem Glutamatsensor	72
5.2.5	Spritzenpumpen	75
5.2.6	Gewinnung von Parotisspeichel	82
6.	Ergebnisse	83
6.1	Absorptionsspektren des Co-Enzyms NADPH	83
6.2.	Bestimmung der GLDH-Aktivität mit dem Photometer	84
6.2.1	Kalibration der GLDH mit dem Photometer	86
6.3	Evaluierung des Ammonium-Assays mit dem Glutamatsensor	87
6.3.1	Flussratenabhängigkeit des Glutamatsensors	87
6.3.2	Einfluss von 2-Oxoglutarat auf den Glutamatsensor	88
6.3.3	Effekt von 2-Oxoglutarat auf die GLOD-Aktivität	89
6.3.4	Variation von 2-Oxoglutarat im Photometer-Assay	90
6.3.5	Variation von NADPH im Photometer-Assay	92
6.3.6	Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der GLDH-Aktivität	93
6.4	Evaluierung des Ammonium-Assays mit dem Glutamatsensor unter Einsatz der Spritzenpumpen	95
6.4.1	Berechnung des Totvolumens der Messapparatur	95
6.4.2	Verschleppungen von Glutamat im Sensor	98
6.4.3	Verschleppung der Glutamat-Dehydrogenase im Messsystem	98
6.4.4	Präzisionstest der Spritzenpumpen	99
6.5	Vergleich des Ammonium-Assays innerhalb und außerhalb des Mikrosystems	102
6.5.1	Ammoniumkalibration innerhalb des Mikrosystems	102
6.5.2	Ammoniumkalibration im Reagenzglas	102
6.6	Einfluss von endogenem Glutamat auf den Ammonium-Assay	103
6.6.1	Einfluss von endogenem Glutamat auf den Photometer-Assay	104
6.6.2	Einflusses von endogenem Glutamat auf den Sensor-Assay	105
6.7	Reproduzierbarkeit des Ammonium-Assays	107
6.8	Bestimmung der Wiederfindungsrate von Ammonium im Sensor-Assay	108
6.9	Korrelation der Sensorergebnisse mit der Referenzmethode	109
6.10	Evaluierung einer möglichen Korrelation von Ammonium im Speichelund im Plasma	110
6.10.1	Ammoniumgehalt der Speichel- und Plasmaproben	111
6.10.2	Ammonium-und Kaliumgehalt des Parotisspeichels in Abhängigkeit von der Flussrate	112
6.10.3	Vergleich von Ammonium und Kalium im Parotisspeichel	114
6.10.4	Korrelation des Ammoniumgehalts im Speichel und im Plasma	115
6.10.5	Ammonium- und Kaliumgehalt im Parotisspeichel in Abhängigkeit von der Flussrate und der gesammelten Probenmenge	116
7.	Diskussion	118
8.	Kapitel-übergreifende Diskussion und Ausblick	121
9.	Anhang	123
9.1	Abkürzungen und Symbole	123
9.2	Zusammensetzung der beim oralen-Aminosäure-Toleranz-Test eingesetzten Aminosäuremischung der SHS-Gesellschaft	124
9.3	Massenwirkungsgesetz	125
10.	Literatur	126

Textprobe:

Zusammenfassung:

Ziel der Doktorarbeit war es, möglichst schmerzfreie Monitoring-Verfahren zu entwickeln und entsprechende Probennahme-Systeme mit bioanalytischen Techniken zu kombinieren, um ein kontinuierliches Monitoring klinisch relevanter Metaboliten wie Glukose, Laktat und Ammonium bei stoffwechselkranken Kindern zu etablieren.

Ein kontinuierliches und simultanes Monitoring von Glukose und Laktat im subkutanen Gewebe konnte durch die Kombination der „Mikrodialyse“ als Probennahme-System mit einem „Bioanalytischen Mikrosystem“ mit integrierten Biosensoren als Analysemethode ermöglicht werden. Durch den Einsatz des CMA-70 Mikrodialyse-Katheters, der ursprünglich für neurologische Untersuchungen entwickelt wurde, ist eine minimal-invasive Probennahme ohne lokale Anästhesie möglich. Bei einer Flussrate von 0,3 ml pro Minute konnte in-vitro eine Wiederfindungsrate (in-vitro Recovery) für Glukose von nahezu 100 % erzielt werden. Sie ist definiert als die relative Konzentration des Analyten im Dialysat bezogen auf dessen Konzentration in der untersuchten Lösung. Die Wiederfindungsrate des untersuchten Analyten im Verlaufe einer in-vivo Messungen (relative Recovery) ist definiert als die relative Konzentration des Analyten im Dialysat bezogen auf dessen Konzentration im Plasma. Es konnte gezeigt werden, dass die relative Recovery von Glukose im subkutanen Fettgewebe, in Abhängigkeit vom Körpermassen-Index (BMI) der untersuchten Probanden, stark variiert. Die relative Recovery von Glukose im subkutanen Gewebe nimmt mit zunehmendem BMI der Probanden ab. Wird jedoch der Quotient des Glukosegehalts im Plasma und im subkutanen Gewebe gebildet, so zeichnet sich sowohl bei den schlanken als auch bei den adipösen Probanden, für die Messzeit von bis zu sechs Stunden, ein relativ stabiler Verlauf der Kurve ab. Der Quotient liegt bei schlanken Probanden (n=4) im Mittel bei 1,1 ± 0,08, während er bei adipösen Probanden (n=4) im Bereich von 3,65 ± 0,44 liegt.

Sowohl die Höhe als auch der Verlauf des Quotienten Plasma/subkutanes Gewebe geben Aufschluss über die Versorgung des Gewebes und den Metabolismus von Glukose. Ein relativ stabiler Quotient im Verlaufe einer Untersuchung hat zur Folge, dass die gemessenen Glukosewerte im subkutanen Gewebe repräsentativ die Situation im Plasma widerspiegeln. Durch eine in-vivo Kalibration des Sensorsignals unter konstanten Bedingungen kann demzufolge von den Messwerten in subkutanen Gewebe, unabhängig von der relativen Recovery, auf die realen Glukosewerte im Plasma geschlossen werden.

Die Erhöhung von Laktat im subkutanen Gewebe nach Glukose-Einnahme zeigt, dass Laktat nicht nur im Muskel, sondern auch im subkutanen Fettgewebe produziert wird und demzufolge eine bedeutende Rolle bei der Glukosehomöostase im Körper übernimmt.

Eine gute Korrelation der Ergebnisse mit der Referenzmethode (CMA-Analysator) spricht für die Stabilität und die Zuverlässigkeit der Sensoren und ermöglicht den Einsatz des gekoppelten Systems in der medizinischen Forschung sowie in der klinischen Diagnostik.

Die Bestimmung von Ammonium mit einem „Bioanalytischen Mikrosystem”, welches in einem tragbaren Analysator mit Computer gesteuerten Spritzenpumpen integriert ist, ermöglicht ein „bedside-monitoring“ von Ammonium im Parotisspeichel.

Durch die Integration der Probenumwandlung und der Detektion des Analyten im „Bioanalytischen Mikrosystem“ wird eine Reduktion des erforderlichen Reagenzien- und Probenvolumens ermöglicht und die Zuverlässigkeit der durchgeführten Analyse erhöht.

Der Einsatz einer transparenten Sammelvorrichtung „Curby-Cup“ zur non-invasiven Gewinnung von Parotisspeichel ermöglicht eine schmerzfreie Probensammlung direkt aus der Glandula-Parotis.

Untersuchungen zur Flussratenabhängigkeit des Ammoniumgehalts im Parotisspeichel und dessen Vergleich mit dem Verhalten von Kalium weisen auf unterschiedliche Transportmechanismen der beiden einwertigen Ionen hin. Während sowohl Ammonium als auch Kalium bei Flussraten unter 0,2 ml/min mit steigender Flussrate und steigendem Probenvolumen abnehmen, erreicht Kalium bei Flussraten ³ 0,2 ml einen konstanten Wert von 23,50 ± 3,03 mM, der Ammoniumgehalt sinkt dagegen mit zunehmender Flussrate weiterhin ab. Erst bei einer Flussrate ³ 0,6 ml/min erhält man einen relativ stabilen Wert von 61,80 ± 13,34 der sich allmählich dem Plasmawert nähert.

Kalium, das im Parotisspeichel um einen Faktor von 5,8 über dem in der Literatur angegebenen Plasmawert (4,03 mM) liegt, wird offensichtlich aktiv in den Speichel transportiert, während Ammonium einem passiven Transport unterliegt.

Kalium kann somit nicht als interner Standard (zur Bestimmung der Flussrate) bei der Ammoniummessung eingesetzt werden. Eine gute Korrelation des Ammoniumgehalts im Parotisspeichel und im Plasma kann offensichtlich nur erzielt werden, wenn eine hohe Flussrate von bis zu 1 ml/min erreicht und die zuerst gesammelte Speichelprobe verworfen wird.

Die Durchführung eines „oralen Aminosäure-Toleranz-Testes“ (oATT) bei gesunden Probanden zeigt jedoch auch bei hohen Flussraten keine sehr gute Korrelation. Dies kann dadurch erklärt werden, dass der Ammoniumgehalt im Plasma, durch die Aktivität der Leber konstant niedrig gehalten wird, während er im Speichel durch den erhöhten Abbau des in der Leber produzierten und ins Blut abgegebenen Harnstoffs ansteigt. Eine gute Korrelation von Ammonium im Parotisspeichel und im Plasma ist jedoch zu erwarten, wenn eine vergleichbare Untersuchung bei stoffwechselkranken Patienten durchgeführt wird, da in diesem Falle ein Ammonium-Anstieg im Plasma, der durch die verminderte Aktivität des Harnstoffzyklus in der Leber verursacht wird, voraussichtlich auch mit einem Anstieg des Ammoniumgehalt im Speichel korreliert ist.