Interaktionsanalyse von Brix, einem Protein von Xenopus laevis, das in der Ribosomenbiogenese involviert ist

Es wurde eine hoch effiziente additionelle Hefetransformation nach dem 60x Ansatz des „2 Hybrid System TRAFO Protocol“ der Homepage des Gietz Labors (http://www.umanitoba.ca/faculties/medicine/biochem/gietz/2HS.html) und durchgeführt: Transformiert wurden ein Baitkonstrukt (pEG202) mit einem bekanntem Insert (BRIX) und die Xenopus laevis- cDNA- Bank im Prey- Vektor (pJG4-5) in einen Reporterstamm, der ein Reporterplasmid enthielt (EGY48[p8op-LacZ]). Wichtig bei diesem Protokoll sind die zwei Wachstumsphasen vor der eigentlichen hocheffizienten Transformation mit der cDNA- Bank. In der ersten Phase werden die Zellen bis zu einer Dichte von etwa 1-2x107Zellen/ml angezüchtet und dabei das erste Plasmid (Bait = pEG202+BRIX- Insert) in den Zellen gehalten. In der zweiten Wachstumsphase werden die Zellen dann in YPD- Medium für 2 Zellteilungen subkultiviert ohne einen signifikanten Plasmidverlust, sofern sich das Plasmid nicht negativ auf das Zellwachstum auswirkt (Agatep et al., 1998). 1.) Ein geeigneter Stamm (hier: EGY48 mit dem Reporterplasmid pSH18-34) wird mit dem erstem Plasmid (pEG202 mit BRIX als Insert) transformiert und ausgetestet auf eine eventuelle Reporteraktivierung. 2.) Erste Wachstumsphase mit Plasmiderhaltung: Mit diesem Stamm werden nun 100ml SD –His Medium so angeimpft, dass die Kultur nach einer ONWachstumsphase im Schüttelinkubator bei 30°C und 200rpm die Zelldichte am nächsten Tag etwa 1-2x107 Zellen/ml beträgt. 3.) Zweite Wachstumsphase: Am nächsten Tag sollen 300ml YPD (auf 30°C vorgewärmt) mit 1,5x109 dieser Zellen inokuliert werden. Dazu muss kurz davor der Zelltiter einer Probe aus der gut durchmischten Kultur mit einer Neubauer Zählkammer erfasst werden. 4.) Das für das Animpfen des YPD notwendige Kulturvolumen wird in einem passenden sterilen Zentrifugierbecher bei 3000g, 5 Minuten und 30°C zentrifugiert. Das Pellet wird steril mit einer Pipette in 50ml vorgewärmtem adaptiert [...]

II.) „Interaction Mating“: Für Two- Hybrid Anwendungen in großem Maßstab (Interaktionsarrays für die ORFs eines ganzen Genoms), wird typischerweise ein „Interaction Mating“ herangezogen. Das Interaction Mating ist aber auch durchaus brauchbar für Interaktionsuntersuchungen an kleineren Sets von gerichtet klonierten Genen oder eines bestimmten Baits gegen eine Expressionsbank. Dabei werden zwei Hefestämme mit verschiedenen Markern und des entgegengesetzten Paarungstyps mit je einem Plasmid (entweder Bait oder Prey) transformiert. Werden nun diese zwei Stämme zusammengebracht, fusionieren sie und bei einer Interaktion können die Reportergene aktiviert werden. Der wesentliche Vorteil dieser Technik ist die Reduktion der Zahl von Hefetransformationen, die für das Austesten von individuellen Interaktionen nötig sind. Diese Technik ist also vorteilhaft beim gezielten Test auf Interaktion zwischen zwei bekannten Proteinen. Ein Beispiel: Wollte man 5 Bait Proteine gegen ein Set von 5 Prey Proteinen austesten und dabei immer zwei Plasmide (Bait+Prey) gleichzeitig in einen Stamm transformieren, so wären dazu 25 Transformationen notwendig, um alle Kombinationen von Bait und Prey zu ermöglichen. Dagegen müssten für das Mating nur 5 Baittransformationen und 5 Preytransformationen (in die unterschiedlichen Stämme) geschehen, diese dann in allen Kombinationen fusionieren zu lassen. Das ist vor allem zeitsparend, wenn Stämme vorhanden sind, die schon mit den Prey- Plasmiden transformiert waren und nun mit neu konstruierten Baits getestet werden sollen. III.) Additionelle Transformation: Sind die Plasmide gleichzeitig vorhanden und sollen zur gleichen Zeit alle untereinander getestet, so eignet sich eine sequenzielle Transformation in den meisten Fällen besser, da dann die Mating Prozedur entfällt und man daher auch nur einen Reporterstamm braucht. Bei dieser Technik werden zuerst die Baits transformiert, auf ihre Eigenschaften untersucht und dann erst diese Stämme mit der Prey transformiert. Allerdings lässt diese zweite Methode nicht zu, dass die Prey- Konstrukte schon vor dem Screen - in einem Stamm den man gleich weiterverwenden kann - auf ihre Eigenschaften untersucht werden. Diese Methode ist ideal für das Screenen einer Genbank gegen ein bekanntes Gen. Nun aber zum tatsächlich verwendeten Transfomationsprotokoll: [...]

Die DNA-Sequenzierungen erfolgten mit „ABI PRISM™ Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit“ der Firma Applied Biosystems. Die Analyse der Sequenz von DNA beruht auf dem Einbau von Didesoxynucleotiden, die in der Nucleotidmischung in einem relativ kleinen Teil vorhanden sind und bei ihrem Einbau zu einen Kettenabbruch während der Elongation führen (Sanger et al., 1977). In dieser Methode wird ein sogenannter „Terminator Premix“ eingesetzt, der die 4 dNTP´s und gleichzeitig einen geringen Anteil an den 4 DNA-Basen in Form von fluoreszenzmarkierten Didesoxynucleotiden (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) und dies ermöglicht es die Sequenzierreaktion für alle 4 Nucleotide in einem Ansatz durchzuführen, da die Farbstoffe Nucleotidspezifisch sind. Der Premix enthält weiters die DNA-abhängige DNA-Polymerase AmpliTaq. Gibt man diesem Premix die zu sequenzierende ds(ss)DNA sowie ein geeignetes Oligonucleotid als Primer zu und unterzieht es einem PCR-ähnlichem Verfahren, dem Cycle Sequencing, so erhält man eine große Anzahl von DNA- Fragmenten, die als Startpunkt den Primer tragen und bis zum zufälligen Einbau des ddNTP verlängert wurden. Welches Didesoxynucleotid nun auf welcher Stelle des Fragments eingebaut wurde, wertet ein automatischer Sequencer aus; dabei wird der fertige Sequenzierreaktion über eine Kapillarelektrophorese so aufgetrennt, dass ein Laserstrahl die Fluoreszenz jeder einzelnen Kettenlänge separat messen kann und demnach auch, welche Base an welcher Position der Kette liegt. Dabei kann mit dieser Methode, je nach Kapillarlänge und Qualität der Reaktion (Templatereinheit; Primereigenschaften; ...) eine Länge von 500-700bp sequenziert werden. [...]