Identifizierung und Nachweis von immunreaktiven Proteinen in unterschiedlichen Sorten der äthiopischen Kulturhirse Eragrostis tef

Diplomarbeit von Anja Gräfe

Einleitung:

Die Unverträglichkeit von Nahrungsmitteln ist weltweit ein verbreitetes und ansteigendes Problem – vor allem in der westlichen Welt. In Europa leiden bis zu 1 % der Erwachsenen und bis zu 4 % der Kinder an einer Nahrungsmittelallergie. Dabei sind einige Lebensmittel besonders prädisponiert für eine Allergie, wobei auch die Ernährungsgewohnheiten der verschiedenen Länder eine Rolle spielen. In Deutschland treten vor allem Allergien gegen Kuhmilch und Hühnerei auf, ferner reagieren Kinder vermehrt auf Weizen. In den USA sind dagegen Allergien gegen Erdnüsse verbreiteter.

Ein größerer Anteil der Bevölkerung, etwa 20 %, ist von einer Nahrungsmittelintoleranz betroffen. Zu den bekanntesten Nahrungsmittelintoleranzen zählen die Laktose-Intoleranz, die Histamin-Intoleranz sowie die Fruktose-Malabsorption.

Einteilung von Nahrungsmittelunverträglichkeiten:

Bei einer Nahrungsmittelallergie handelt es sich um eine durch immunologische Mechanismen hervorgerufene Überempfindlichkeitsreaktion auf bestimmte Nahrungsmittelbestandteile – meist Proteine. Sie kann Antikörper- oder Zell-vermittelt sein. Die bei der ‘klassischen’ Allergie des Typ I gebildeten IgE-Antikörper aktivieren die Mastzellen, welche verschiedene Entzündungsmediatoren freisetzen, wie z. B. Histamin. Bereits geringste Mengen des Allergens können die Immunreaktion auslösen.

Nahrungsmittelintoleranzen können durch bestimmte Nahrungsmittelbestandteile Reaktionen im Körper hervorrufen, die einer allergischen Reaktion ähneln. Aufgrund dessen spricht man auch von einer ‘Pseudo-Allergie’. Die Histaminfreisetzung aus den Mastzellen wird jedoch direkt über die Nahrungsbestandteile und nicht über Antikörper ausgelöst. Bei einer ‘klassischen Unverträglichkeit’ liegt die Ursache an einem Enzymdefekt oder -mangel, der bedingt, dass spezifische Nahrungsmittel, wie z. B. Laktose, nicht verdaut werden können. Auch Organerkrankungen können durch eine ausgelöste Malabsorption zu einer Nahrungsmittelunverträglichkeit führen. Im Gegensatz zur ‘klassischen’ Allergie muss keine vorangehende Immunisierung stattfinden, Reaktionen können bereits beim Erstkontakt auftreten. Ein weiterer Unterschied zur Allergie zeigt sich in der Dosisabhängigkeit der Symptome. Die Tabelle Tab. 1.1 liefert einen Überblick über wesentliche Unterschiede der ‘klassischen’ Nahrungsmittelallergie und der Nahrungsmittelintoleranz.

Die Terminologie für die Charakterisierung einer Nahrungsmittelallergie und einer Nahrungsmittelunverträglichkeit ist teilweise nicht ganz eindeutig. Die European Academy of Allergology and Clinical Immunology (EAACI) empfahl daher 1995 eine Klassifikation auf der Grundlage der Pathomechanismen. Die erste Einteilung besteht zwischen toxischen und nicht toxischen Reaktionen, wobei die Nahrungsmittelallergie und -intoleranz den nicht-toxischen Reaktionen zuzuordnen sind. Diese sind im Gegensatz zu der toxischen Reaktion abhängig von der individuellen Empfindlichkeit auf einen bestimmten Nahrungsmittelbestandteil. Des Weiteren erfolgt eine Klassifikation in Nahrungsmittelallergie, wenn die Reaktion immunologisch vermittelt ist (IgE- oder nicht-IgE vermittelt), und in Nahrungsmittelintoleranz, wenn die Reaktion nicht immunologisch vermittelt ist. Die Nahrungsmittelintoleranz kann differenziert werden in: enzymatisch bedingte Intoleranz (z. B. Laktoseintoleranz) oder Intoleranz durch Störung des Transportsystems (z. B. Fruktoseintoleranz durch genetische Mutation des Darmtransportes), pharmakologische Intoleranz (z. B. Histaminintoleranz) und idiopathische sowie undefinierte Intoleranz (z. B. Reaktionen auf Zusatzstoffe).

Die Zöliakie zählt auf Grund des Auftretens hochspezifischer Autoantikörper gegen Gewebstransglutaminase zu den Autoimmunerkrankungen. Abzugrenzen von der Zöliakie ist die Glutensensitivität, welche dieselben Symptome zeigt, aber keine Autoantikörper gegen Gewebstransglutaminase aufweist.

Zielsetzung der Diplomarbeit:

Im Vordergrund dieser Arbeit steht das Ziel, die Lebensqualität für Zöliakie-Patienten deutlich zu verbessern. Dazu werden 48 verschiedene Getreidesorten im Hinblick auf immunreaktive Bestandteile näher untersucht. Das besondere Augenmerk liegt dabei auf der äthiopischen Kulturhirse Eragrostis tef, die bisher als glutenfrei gilt, obwohl dennoch 17 % der Zöliakie-Patienten nach Verzehr mit einer krankheitsspezifischen Symptomatik reagieren. Die Arbeitsgruppe von Spaenij-Dekking et al. konnte in 14 verschiedenen Teff-Sorten keine bekannten immunreaktiven Glutenbestandteile nachweisen. Um dies zu wiederlegen, sollen die Proteine aus verschiedenen Teff-Sorten sowie Kontrollgetreide-Sorten, wie z. B. Weizen, Gerste und Roggen, aufgereinigt werden und im Immunoblot mit Zöliakie-Patientenseren, affinitätsgereinigten Patientenantikörpern, alpha-Gliadin-Antikörpern und mit bereits gegen relevante immunreaktive Bestandteile des Gliadins hergestellten Antikörpern mögliche Proteine identifiziert werden, die bei Verzehr zum Wiederaufflammen der Zöliakie führen. Da auch Weizenallergiker auf Gluten immunreaktiv reagieren, soll zusätzlich die IgE-vermittelte Reaktion an den verschiedenen Getreidesorten, speziell an Teff, untersucht werden.

Des Weiteren soll geprüft werden, ob es Unterschiede in der Proteinzusammensetzung der zu untersuchenden Teff-Sorten gibt, und wenn ja, ob sich diese in der Immunreaktivität widerspiegeln.

Die intestinale Transglutaminase spielt bei der Zöliakie eine entscheidende Rolle, vermutlich auch bei der Weizenallergie. Derzeitig existieren widersprüchliche Ergebnisse in Studien, die den Einfluss von Transglutaminierung auf Gluten bei Zöliakie-Patienten untersuchten, d. h., es ist nicht eindeutig geklärt, ob die Transglutaminierung von Gluten eine Steigerung oder Senkung der Immunreaktivität bewirkt. In der wheat-dependent, exercise-induced anaphylaxis zeigt eine Studie die Erhöhung der IgE-Reaktivität durch Transglutaminase. Da der Einsatz von Transglutaminasen in der Lebensmittelindustrie eine bedeutende Rolle spielt, gilt zu klären, ob ein Einfluss auf die Unverträglichkeit von Nahrungsmitteln besteht. Hierzu werden die aufgereinigten Getreideproteine vor der Durchführung des Immunoblots zusätzlich mit Transglutaminase modifiziert.

Im zweiten Teil dieser Arbeit sollen in der Firma in.vent zwei Antikörper, die gegen immunreaktive Bestandteile des Gliadins gerichtet sind, affinitätsgereinigt werden, um sie dann zur Herstellung eines einfach durchzuführenden Streifentests (Lateral Flow Assay) einzusetzen. Dieser Test soll Verbrauchern, insbesondere Zöliakie-Patienten, ermöglichen, geringste Mengen von Gluten in Nahrungsmitteln schnell und zuverlässig nachzuweisen, um ihre Lebensqualität zu verbessern. In der Firma in.vent sollen die ersten Vorversuche an Dipsticks durchgeführt werden, um verschiedenste Parameter zur Herstellung eines spezifischen Glutentests zu optimieren und die Gluten-Nachweisgrenze zu ermitteln.

Inhaltsverzeichnis:

Textprobe:

Kapitel 2.2, Proteinbiochemische Methoden:

2.2.1, Extraktion von Gluten aus Mehl:

Um die einzelnen Glutenfraktionen aus Tef- und Weizenmehl zu gewinnen, wurde die Methode von Akagawa et. al. mit einigen Modifikationen angewandt. Es wurden jeweils 2 g Mehl eingewogen und 10 ml 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,8) dazu gegeben. Nach 1 h Inkubation bei 4 °C rührend und anschließender Zentrifugation bei 20000 x g für 20 min bei 4 °C wurde der Überstand (Albumine/Globuline) gesammelt. Das Pellet wurde dreimal mit jeweils 5 ml 50 mM Tris-HCL-Puffer gewaschen und je 5 min bei 20000 x g zentrifugiert. Dem Rückstand wurden 10 ml 75 %iger Ethanol zugefügt, und er wurde über Nacht bei 4 °C auf dem Rührer gemischt. Die Suspension wurde am Folgetag erneut bei 20000 x g für 20 min bei 4 °C zentrifugiert, und aus dem Überstand wurde die Prolaminfraktion gewonnen. Das Pellet wurde, wie bereits zuvor beschrieben, gewaschen, in diesem Fall mit 75 %igem Ethanol. Die Glutelinfraktion wurde im Anschluss mit 10 ml 50 mM Tris-HCl (pH 8,8) mit 1 % SDS und 0,5 % DTT durch 2 h Rühren bei 4 °C extrahiert. Nach der Zentrifugation bei 20000 x g für 20 min bei 4 °C wurde der Überstand gesammelt. Jede der gesammelten Fraktionen wurde 1:2 mit Harnstoff-Puffer (8 M Urea, 40 mM Tris und 40 % Tween 20) verdünnt und bei -20 °C gelagert.

Aufkonzentrierung der Tef-Prolaminfraktion:

Zur Aufkonzentrierung der Proteinlösung wurde ein Amicon Ultra-4 Filtrationsröhrchen mit einem Ausschlussvolumen von 10 kDa eingesetzt. Es wurden 4 ml der Tef-Prolaminfraktion auf die Säule aufgetragen und bei maximal 2800 x g für ca. 30 min zentrifugiert.

2.2.2, Proteinextraktion aus Getreide mittels P-PER® Plant Protein Extraction Kit:

Der P-PER-Kit der Firma Pierce umfasst ein organisches Lyse-Reagenz und zwei wässrige Reagenzien, die in Verbindung mit leichter mechanischer Bewegung effektiv pflanzliche Proteine extrahieren. Zuerst wurde jeweils zwischen 40 und 50 mg der 48 verschiedenen Getreidesorten in ein 2 ml Reaktionsgefäß eingewogen. Handelte es sich um Samen, wurden diese mit Mörser und Stößel klein gemahlen. Um mögliche Kontaminationen zwischen den verschiedenen Sorten zu vermeiden, wurde der Mörser und Stößel nach jedem Einsatz gründlich mit dest. Wasser und 75 % Ethanol gereinigt. Lag das Getreide bereits als Mehl vor, konnte es direkt eingesetzt werden. Zu den Getreide-Proben wurde dann je 1,75 ml Extraktionspuffer pipettiert. Dieser wurde zuvor laut Beschreibung des P-PER® Plant Protein Extraction Kits angesetzt: 990 µl Reagenz A, 10 ml Reagenz B, 750 µl Reagenz C und gründlich vermischt. Nachdem der Getreide-Extraktionsansatz sorgfältig auf dem Vortexter gemixt wurde, erfolgte eine Zentrifugation bei 4500 x g für 5 min. Die gelösten Proteine befanden sich danach in der mittleren Phase und wurden vorsichtig in ein neues Reaktionsgefäß überführt und bei -20 °C gelagert.

2.2.3, Proteinbestimmung:

Um die gelösten Proteine in der Extraktionslösung zu bestimmen, wurde das Pierce® 660 nm Protein Assay Reagenz eingesetzt. Der Test ist linearer als Coomassie-basierte Bradford Assays und kompatibel mit höheren Konzentrationen der meisten Detergenzien, Reduktionsmittel und anderen häufig eingesetzten Reagenzien. Die Methode basiert auf der Bindung eines Farbstoff-Metall-Komplexes mit Proteinen unter sauren Bedingungen. Dies verursacht eine Verschiebung des Farbstoffabsorptionsmaximums von rötlich nach grün, welches bei 660 nm gemessen werden kann. Der Farbstoff interagiert vor allem mit den basischen Aminosäuren, wie Histidin, Lysin und Arginin, und in geringerem Maße mit Tyrosin, Tryptophan und Phenylalanin. Für die Durchführung wurden 750 µl Assay Reagenz zu 50 µl Probe pipettiert, 5 min inkubiert und in einer Halbmikroküvette bei 660 nm am Photometer gemessen. Für die Standardreihe wurde BSA (bovine serum albumin) genutzt.

2.2.4, SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese:

Diese Form der Elektrophorese ermöglicht die Auftrennung von Proteinen in einem Polyaccrylamid-Gel nach ihrem Molekulargewicht. Durch SDS (Sodiumdodecylsulfat), welche sich an die Proteine anlagert, wird die Eigenladung der Proteine überdeckt, und es entstehen negativ geladene SDS-Protein-Komplexe mit einem konstanten Ladungs- zu Masse-Verhältnis. Des Weiteren denaturiert SDS die Proteine und zerstört ihre Quartärstruktur. Zur Reduktion von Disulfidbrücken wird Dithiothreitol (DTT) eingesetzt. Die negativ geladenen Proteine unterscheiden sich letztlich nur noch durch ihre Größe und wandern im elektrischen Feld vom Negativ- zum Pluspol.

In der vorliegenden Arbeit wurden die notwendigen Gele gegossen, bestehend aus 4 %igen Sammelgel und 10- oder 12,5 %igen Trenngel (Tab. 2.3 und Tab. 2.4).

Bevor ein Gel mit den Proben beladen werden konnte, wurden die Proteinproben mit dest. Wasser auf eine einheitliche Proteinkonzentration eingestellt und mit 6xLaemmli-Puffer versetzt. Nach der Denaturierung der Proteine bei 95 °C für 5 min wurden die Ansätze auf das Polyacrylamid-Gel aufgetragen (maximal 24 µl Probe/Tasche bei insgesamt 10 Taschen). Als Größenstandard wurden 5 µl des BlueRanger® Prestained Protein Molecular Weight Marker Mix der Firma Pierce eingesetzt (nur in einem Coomassiegel zur Affinitätschromatographie über Protein A wurde der Benchmark Protein Ladder der Firma Invitrogen verwendet). Die elektrophoretische Auftrennung der Proteine erfolgte mit Hilfe des Elektrophoresepuffers bei einer Stromstärke von 25 mA. Gekühlt wurde das System mit dem Wasserkühler.