Identifizierung und Charakterisierung des HSP70 Makronukleus-Gens aus Euplotes crassus
- Art: Diplomarbeit
- Autor: Ulrich Reidt
- Abgabedatum: Mai 1998
- Umfang: 83 Seiten
- Dateigröße: 4,8 MB
- Note: 1,5
- Institution / Hochschule: Philipps-Universität Marburg Deutschland
- ISBN (eBook): 978-3-8324-1008-7
-
ISBN (Paperback) :
978-3-8324-1008-7 P - ISBN (CD) :978-3-8324-1008-7 CD
- Sprache: Deutsch
- Prämierung:
- Arbeit zitieren: Reidt, Ulrich Mai 1998: Identifizierung und Charakterisierung des HSP70 Makronukleus-Gens aus Euplotes crassus, Hamburg: Diplomica Verlag
- Schlagworte: Hitze-Schock-Protein70 (HSP70), polymerase chain reaction, Promotor-Elemente, Ciliaten, Hitze-Schock-Elemente (HSE)
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Diplomarbeit von Ulrich Reidt
Zusammenfassung:
Bei dem hypotrichen Ciliaten E.crassus wurde das Makronukleus-Chromosom, welches das HSP7O-Gen trägt, identifiziert. Für die Identifikation eines internen Gen-Fragmentes wurde die Methode der heterologen PCR angewendet. Die 5'- und 3'-Enden des Gens konnten mit einem telomerspezifischen Primer und mit homologen Primern, die aus dem internen PCR-Fragment abgeleitet wurden, amplifiziert werden. Nach Sequenzierung der PCR-Fragmente und einem Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen mit Aminosäuresequenzen aus weiteren Organismen wurde eine Homologie von bis zu 95 % festgestellt.
Untersuchungen zur Kopienzahl zeigten, daß im Makronukleus das HSP7O-Gen in einer Kopienzahl von 2000-2500 Kopien vorlag. Dies entsprach der durchschnittlichen Kopienzaht von E.crassus.
Um Promotor-Elemente zu identifizieren, wurde der Transkriptionsstartpunkt bestimmt. Eine Analyse der 5'-nicht kodierten Region zeigte, daß keine Sequenzhomologie zu den bekannten core-Promotor-Elementen TATA-Box und Initiator-Element bestand. Durch Sequenzvergleiche mit der bekannten Konsensussequenz der Hitze-Schock-Elemente wurden jedoch zwei Hitze-Schock-Elemente identifiziert.
Weitere Untersuchungen zur Expression des HSP7O-Gens nach Hitzeschock und ohne Hitzeschock erfolgten sowohl auf der Ebene der RNA als auch auf der Protein-Ebene. Durch eine Northern-Blot-Analyse wurde eine erhöhte Transkripmenge der HSP70-mRNA in hitzeinduzierten Ciliaten festgestellt. Auf der Protein-Ebene zeigte sich jedoch kein quantitativer Unterschied zwischen hitzeinduzierten und nicht hitzeinduzierten Zellen.
Inhaltsverzeichnis:
| 1. | ZUSAMMENFASSUNG | 1 |
| 2. | EINLEITUNG | 2 |
| 2.1 | Die Genomorganisation des hypotrichen Ciliat Euplotes crassus | 2 |
| 2.2 | Konjugation und Makronukleusentwicklung bei Euplotes crassus | 4 |
| 2.3 | Transk:riptinelle Regulation der Genexpression | 5 |
| 2.4 | Transkriptionelle Regulation der Genexpression am Beispiel der Hitzeschockgene | 7 |
| 2.5 | Ziel der Arbeit | 8 |
| 3. | MATERIAL | 9 |
| 3.1 | Chemikalien | 9 |
| 3.2 | Radioisotope | 10 |
| 3.3 | Verbrauchsmaterialien | 10 |
| 3.4 | Geräte | 11 |
| 3.5 | Enzyme | 12 |
| 3.6 | Primer | 12 |
| 3.7 | Organismen | 14 |
| 3.8 | Plasmide und Gene | 14 |
| 4. | METHODEN | 15 |
| 4.1 | Kultivierung | 15 |
| 4.1.1 | Kultivierung von Dunaliella tertiolecta | 15 |
| 4.1.2 | Kultivierung von Euplotes crassus | 15 |
| 4.1.3 | Kultivierung von Escherichia coli | 16 |
| 4.2 | Herstellung RNase-freier Geräte und Lösungen | 16 |
| 4.2.1 | Geräte und Allgemeines | 16 |
| 4.2.2 | Lösungen | 16 |
| 4.3 | Reinigung und Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren | 17 |
| 4.3.1 | Phenolextraktion | 17 |
| 4.3.2 | Ethanolfällung | 17 |
| 4.3.3 | Isopropanolfällung | 17 |
| 4.3.4 | Butanolfällung | 18 |
| 4.3.5 | Elution von DNA aus Agarosegelen mit Hilfe des "QIAquick Gel Extraction Kits" | 18 |
| 4.3.6 | Entfernung von Nukleotide und Salze aus der DNA durch das "QIAquick Nucleotide Removal Kit" | 18 |
| 4.3.7 | Aufreinigung von PCR-Ansätze mit Hilfe des "QIAquick PCR Purification Kit" | 19 |
| 4.3.8 | Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren | 19 |
| 4.3.9 | Elution von DNA aus Agarosegelen durch Einfrieren und Ausquetschen | 19 |
| 4.4 | Präparation von Nukleinsäuren | 20 |
| 4.4.1 | Präparation von RNA | 20 |
| 4.4.2 | Präparation von DNA aus Euplotes crassus | 20 |
| 4.4.3 | Plasmidisolierung aus Escherichia coli in kleinerem Maßstab | 21 |
| 4.4.4 | Plasmidisolierung aus Escherichia coli größerem Maßstab | 21 |
| 4.5 | Amplifikation von DNA-Fragmenten mittels der PCR | 21 |
| 4.6 | Klonierung von DNA-Fragmenten in Plasmidvektoren | 23 |
| 4.6.1 | DNA-Spaltung mit Restriktionsendonukleasen | 23 |
| 4.6.2 | DNA-Ligation | 23 |
| 4.6.3 | Herstellung eines "T-Vektors" | 23 |
| 4.6.4 | Klonierung von PCR-Fragmenten | 24 |
| 4.6.5 | Herstellung elektrokompetenter E. coli Zellen | 24 |
| 4.6.6 | Elektroporation von E. coli | 25 |
| 4.7 | Gelelektrophoresen | 25 |
| 4.7.1 | DNA-Agarose-Gelelektrophorese | 25 |
| 4.7.2 | Deneturierende-Formaldehyd-Gelelektrophorese | 26 |
| 4.7.3 | SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese | 26 |
| 4.8 | Herstellung des Proteinextraktes | 26 |
| 4.9 | Transfer von Nukleinsäuren auf Nylonmembran | 27 |
| 4.9.1 | Transfer von DNA durch einen nach unten gerichteten alkalischen Kapillartransfer | 27 |
| 4.9.2 | Transfer von RNA durch einen nach unten gerichteten nicht alkalischen Kapillartransfer | 27 |
| 4.10 | Methylenblau-Färbung von rRNA auf Nylonmembranen | 27 |
| 4.11 | Markierung von Nukleinsäuren | 28 |
| 4.11.1 | Radioaktive DNA-Markierung mit a[32P]-dATP (Random Primimg) | 28 |
| 4.11.2 | Nicht radioaktive DNA-Markierung mit DIG-dUTP (Random Priming) | 28 |
| 4.12 | Hybridisierung von Nukleinsäuren | 28 |
| 4.12.1 | Radioaktive DNA-DNA- und DNA-RNA-Hybridisierung | 28 |
| 4.12.2 | Nicht radioaktive DNA-DNA-Hybridisiemng | 29 |
| 4.13 | Übertragung von Proteinen auf Nitrocellulosemembran (Western-Blot) | 30 |
| 4.14 | Tintenfärbung der Proteine auf Nitrocellulosemembran | 30 |
| 4.15 | Immunologische Detektion von Proteinen | 30 |
| 4.16 | Bestimmung des Transkriptionsstartpunkt ("primer extension") | 31 |
| 4.17 | Sequenzierung nach der Didesoxynukleotid-Methode im automatischen Sequenzer | 32 |
| 5. | ERGEBNISSE | 33 |
| 5.1 | Amplifikation eines DNA-Fragmentes des HSP70-Gens | 33 |
| 5.2 | Bestimmung der Länge des Makronukleus-Chromosoms, das das Gen HSP70 trägt | 35 |
| 5.3 | Amplifikation der 5’- und 3’-Bereiche des Gens HSP70 | 36 |
| 5.4 | Nukleotid- und Aminosäuresequenz des Makronukleus-Chromosoms, das das Gen HSP70 aus E. crassus kodiert | 37 |
| 5.5 | Berechnung der Molekülmasse des Hitzeschockproteins hsp70 aus E. crassus | 41 |
| 5.6 | Abschätzung der relativen Kopienzahl des Gens HSP70 in E. crassus | 41 |
| 5.7 | Bestimmung der Transkriptmenge in hitzeinduzierten und nicht hitzeinduzierten Zellen | 43 |
| 5.8 | Transkriptionsstartpunktbestimmung des HSP70-Gens | 49 |
| 5.9 | Nachweis von hsp70 im Zellextrakt aus E. crassus | 49 |
| 6. | DISKUSSION | 51 |
| 6.1 | Vergleich der HSP70-Gene anderer Organismen mit dem Gen HSP70 aus Eplotes crassus | 51 |
| 6.2 | Vergleich der Molekülmasse des Hitzeschock-Proteins hsp70 mit der Molekülmasse weiterer hsp70 anderer Organismen | 52 |
| 6.3 | Ansteigung der Transkriptmenge des Gens HSP70 nach einer Temperaturerhöhung | 53 |
| 6.4 | Analyse der 5'-nicht kodierenden Region des HSP70-Gens | 54 |
| 6.5 | Ausblick | 56 |
| 7. | LITERATURVERZEICHNIS | 57 |
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Link zur Arbeit:
http://www.diplom.de/ean/9783832410087
Arbeit zitieren:
Reidt, Ulrich Mai 1998: Identifizierung und Charakterisierung des HSP70 Makronukleus-Gens aus Euplotes crassus, Hamburg: Diplomica Verlag
Schlagworte:
Hitze-Schock-Protein70 (HSP70), polymerase chain reaction, Promotor-Elemente, Ciliaten, Hitze-Schock-Elemente (HSE)
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