Genexpression in den Hauptzelltypen der Gefäßwand

Die DNA-freie RNA wird mittels einer viralen reversen Transkriptase in cDNA umgeschrieben. Dies ermöglicht eine Amplifikation der Nukleinsäuren mittels PCR. Die Gesamt-RNA-Proben von 3 µg werden mit Aqua bidest.DEPC auf 7,54 µl aufgefüllt. In einer PCR-Apparatur werden die Proben für 10 min bei 65°C denaturiert und anschließend direkt auf Eis gelegt. Nach dem Versetzen und Durchmischen der Proben mit 7,46 µl RT-Mix werden diese in einer PCR-Apparatur für 1 h auf 37°C erwärmt (Deckeltemperatur des PCR-Geräts: 100°C). Durch ein nachfolgendes Erhitzen der Proben auf 90°C für 5 min wird die reverse Transkriptase in der Probe denaturiert. Direkt im Anschluß an das Erhitzen auf 90°C werden die Proben auf Eis gehalten und für die anschließende PCR mit Aqua bidest.DEPC auf 1:20 bis 1:50 verdünnt. Die verdünnten Proben werden aliquotiert und bis zur Weiterverwendung bei -20°C eingefroren. Die Verdünnung der Proben ist notwendig, um eine Beeinflussung der nachfolgenden PCR durch Komponenten des RT-Mixes aus der Erststrang-cDNA-Synthese zu verhindern. [...]

Im ersten Schritt werden nach einem modifizierten Verfahren nach LIANG und PARDEE (1994) chromosomale DNA-Kontaminationen aus den RNA-Proben entfernt. Dies ist notwendig, um eine Koamplifikation der DNA in der nachfolgenden PCR zu verhindern. Die RNA-Proben werden mit 17 µl DNase-Mix pro 50 µg RNA versetzt, mit Aqua bidest.DEPC auf des entsprechende Volumen aufgefüllt und für 30 min bei 37°C inkubiert. Nach der Zugabe von 50 µl eines (25:24:1)-Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol-Gemisches werden die Proben gemischt und für 2 min mit einer Tischzentrifuge bei ≥ 10 000 × g zentrifugiert. Durch diesen Arbeitsschritt wird die Desoxyribonuklease inaktiviert, die sonst in der nachfolgenden reversen Transkription die cDNA zerstören würde. Die obere Phase wird in ein steriles Mikrozentrifugengefäß überführt und mit der gleichen Menge Chloroform versetzt, gemischt und wie oben zentrifugiert. Nach dem Überführen der oberen Phase in ein steriles Eppendorfgefäß werden jeder Probe 5 µl Natriumacetat-Puffer und 200 µl 100%iges Ethanol zugesetzt. Die alkoholische Lösung wird eine halbe Stunde bei –80°C gelagert, um [...]

Polyacrylamid-Gel dient dann der entwickelte Röntgenfilm als Maske. Probleme dieser Methode sind der Einsatz von Radioaktivität, der relativ große Zeitaufwand und erhebliche Schwierigkeiten bei der Lokalisation und Isolierung der cDNA-Banden aus dem Polyacrylamid-Gel. Eine grundlegende Vereinfachung der DDRT-PCR-Methode wurde von LOHMANN et al. (1995) vorgestellt. In dieser nichtradioaktiven Methode werden die PCR-Produkte in einem horizontalen Polyacrylamid-Gel aufgetrennt und anschließend direkt durch eine Silberfärbung sichtbar gemacht. Diese als »RENDisplay« bezeichnete Methode (LOHMANN et al., 1995) ermöglicht die direkte Visualisierung der cDNA und damit eine reproduzierbare und einfach durchzuführende Isolierung der Banden. Ebenso wird die Wahrscheinlichkeit, anstelle des PCR-Fragmentes eines tatsächlich differentiell exprimierten Gens ein koamplifiziertes PCR-Fragment zu klonieren, erheblich geringer (LOHMANN et al., 1995, 1997, BOSCH und LOHMANN, 1996). Dies ist ein nicht zu unterschätzendes Problem der DDRT-PCR. In der Regel wird eine Sequenzheterogenität der isolierten Produkte aus der Differential Display-PCR festgestellt (LEE et al., 1991, CALLARD et al., 1994, FENGSHENG et al., 1994). Werden die isolierten Banden reamplifiziert und in einem Polyacrylamid-Gel aufgetrennt, zeigt sich eine signifikante Kontaminierung der Proben mit unerwünschten Sequenzen. Das bedeutet, daß einzelne Banden meistens zusätzliche, nicht erkennbare und unerwünschte DNA-Fragmente enthalten. Diese Beobachtung steht im Einklang mit der von BAUER et al. (1993) vorgestellten Theorie der DDRTPCR. Die Nachweisgrenze von PCR-Fragmenten in silbergefärbten Polyacrylamid-Gelen liegt im Nanogrammbereich und ist damit etwa 50mal sensitiver als eine Detektion mit Ethidiumbromid und nahezu identisch mit der in konventioneller Autoradiographie (LOHMANN et al., 1997). Der Bereich der hier darstellbaren Fragmentgrößen liegt zwischen 50 und 2 000 Basen. [...]