Fluoreszenzfarbstoffe zur Vitalitätsbestimmung von Mikroorganismen

Diplomarbeit von Ralf Oltmanns

Zusammenfassung:

Im Laufe dieser Arbeit wurden aktive und durch Nährstoffmangel inaktivierte Zellen von Pseudomonas fluorescens in Chemostaten bzw. Schüttelkolben kultiviert. An diesen Bakterienzellen wurden verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe auf ihre Eignung als Indikatoren zur Vitalitätsbestimmung untersucht.

Die Experimente mit den verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen führten zu den folgenden Ergebnissen.

Der AT-spezifische Nucleinsäure-Farbstoff DAPI erwies sich bei einer Konzentration von 20 µg/ml als ein zuverlässiger Nachweis für die Erfassung der Gesamtzellzahl. DAPI ist zudem ein sensibler Indikator für die Zellaktivität und ermöglicht präzise Aussagen über die Zusammensetzung einer Bakterienpopulation in Hinblick auf ihre Vitalität. Im Verlauf der Reaktivierungsversuche teilte sich die Gesamtpopulation aller DAPI-gefärbten Zellen in eine DAPIintensiv- und eine DAPIschwach-gefärbte Teilpopulation, die aktive bzw. inaktive Zellen repräsentieren. Eine Aufteilung mit annähernd gleichen Verhältnissen konnte bei der Untersuchungen der Zellvolumina ermittelt werden. Eine Anfärbung der Zellen durch die Umsetzung des Dehydrogenase-Substratanalogons CTC (1,52 mg/ml) zu seinem konjugierten, fluoreszierenden Formazan ergänzte die DAPI-Färbung und untermauerte ihre Ergebnisse, da das Formazan die Mikroorganismen anzeigt, die über respiratorische Aktivität verfügen.

Auch die Verwendung von 10 µg/ml des Nucleinsäure-Farbstoffes Hoechst 33342 erbrachte bei der Gesamtzellzahlerfassung konsistente und reproduzierbare Ergebnisse, zeigte jedoch im Verlauf von Reaktivierungsversuchen keine signifikanten Unterschiede im Bezug auf die Zellaktivität.

Acridinorange (800 µg/ml), ein unspezifischer Nucleinsäure-Farbstoff mit einem konzentrationsabhängigen rot-grün-Metachroismus, eignet sich wenig für die Kombination mit anderen Farbstoffen. Separat und in geeigneter Konzentration verwendet, vermag AO jedoch durchaus mit unterschiedlicher Intensität der Rotfluoreszenz auf Aktivitätsunterschiede zu reagieren.

Konzentrationen von 100 bis 500 µg/ml des an freie Amino-Funktionen bindenden Farbstoffs FITC ergaben nur sehr kontrastarme Bilder mit starker Hintergrundfluoreszenz und nur geringen, nicht signifikanten Unterscheidung zwischen aktiven und inaktiven Zellen.

Das Esterase-Substratanalogon SFDA (300 µM) und der nur für defekte Zellmembranen permeable DNA-Farbstoff PO-PRO™-3-Iodid (30 µM) erwiesen sich als ungeeignet für Vitalitätsbestimmungen von Pseudomonas fluorescens, da sie zu keinerlei Färbung führten.

Der Einsatz von 0,75 µg/ml des Oxonols DiBAC4(3), das nur durch ungeladene Membranen diffundieren sollte, erfüllte ebenso nicht die Erwartungen und unterschied nicht zwischen den Aktivitätszuständen. Zumindest für die verwendete "Stain-Filter"-Technik ist der Farbstoff nicht geeignet.

Besonders die Farbstoffe DAPI und CTC, im begrenzten Maße auch Acridinorange, geben uns neue Werkzeuge in die Hand, mit denen wir die Aktivitätszustände und das Wachstumsverhalten von Mikroorganismen differenzierter beschreiben können. Bei der Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffe zur Vitalitätsbestimmung von Mikroorganismen sollte jedoch stets bedacht werden, daß jedes Bakterium auf seine Art auf die Färbung reagiert und das die hier dargestellten Ergebnisse so nur für Pseudomonas fluorescens gelten.

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