Etablierung und Evaluierung der quantitativen Bestimmung von Homocystein und den Metaboliten Cystathionin, Methylmalonsäure und 2-Methylzitronensäure im Serum mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie

Dissertation / Doktorarbeit von Martin Busch

Zusammenfassung:

Die Hyperhomocysteinämie (>15 µmol/l) ist ein unabhängiger Risikofaktor zur Entwicklung einer Atherosklerose. Eine Konzentrationsbestimmung im Serum ist bei Personen mit einem erhöhten Risiko zur Entwicklung atherothrombotischer Ereignisse sinnvoll.

Homocystein (HC) steht im Stoffwechselzusammenhang mit Cystathionin (Cys), Methylmalonsäure (MMA) und 2-Methylzitronensäure (MC), wobei die Metabolisierung an die Vitamine B 6, B 12 und Folsäure gekoppelt ist.

Hauptursachen der Erhöhung von HC und seiner Metabolite im Serum sind Mangelzustände an den oben genannten Vitaminen, die chronische Niereninsuffizienz sowie genetische Defekte. Da die Konzentrationen der Metabolite auch bei normalen Serumvitaminspiegeln erhöht sein können, gelten die genannten Substanzen als Marker eines funktionellen, intrazellulären Vitaminmangels. Die Konzentrationsbestimmung ermöglicht darüberhinaus eine Differenzierung der betroffenen Stoffwechselwege und Vitamindefizite.

Die kombinierte Messung von HC und seinen Metaboliten Cys, MMA und MC mit seinen Diastereomeren ist nur mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie möglich.

In der Literatur gibt es bisher nur aus der Arbeitsgruppe von Allen et al. Mitteilungen über die simultane gaschromatographisch-massenspektrometrische Bestimmung von HC, Cys, MMA und MC.

Mit der Etablierung und Evaluierung der Methoden ist die quantitative Bestimmung der genannten Substanzen an der Friedrich-Schiller-Universität Jena möglich geworden.

Für alle Metabolite konnte eine Nachweisbarkeit im Bereich physiologischer Serumkonzentrationen erzielt werden.

Der Intra-Assay-Variationskoeffizient des HC-Assays betrug 3,9% in Konzentrationen zwischen 20 und 58 µmol/l, bei Wiederfindungsraten von im Mittel 100%. Der Inter-Assay-Variationskoeffizient der Konzentration von 15,6 µmol/l lag bei 4,5%. Der Inter-Assay-Variationskoeffizient im Ringversuch 1999 lag bei 3% mit einer mittleren Wiederfindung von 94% bei Konzentrationen von 9, 11,6 ,13,7 ,18,5 und 37,1 µmol/l.

Für die Cys-Bestimmung wurde ein Intra-Assay-Variationskoeffizient von 1,8% mit durchschnittlichen Wiederfindungsraten zwischen 100% und 106% ermittelt (Konzentrationen von 700-1900 nmol/l). Der Inter-Assay-Variationskoeffizient betrug 7% bei 1178 nmol/l.

MMA wurde mit einem Intra-Assay-Variationskoeffizienten von im Mittel 1,25%, Wiederfindungsraten von 98-102% (Konzentrationen von 240-1300 nmol/l) und einem Inter-Assay-Variationskoeffizienten von 9,1% bei 408 nmol/l bestimmt. Der Inter-Assay-Variationskoeffizient im Ringversuch betrug im Mittel 108% mit einem durchschnittlichen Inter-Assay-Variationskoeffizienten von 14,6% (Konzentrationen von 87, 186, 259, 336 und 557 nmol/l).

Für die seltene Bestimmung von MC und seiner Diastereomere im Serum wurden nach dem Stand der Literatur erstmals Präzisionsangaben gemacht. Der Intra-Assay-Variationskoeffizient der Bestimmung von MC betrug 2,6% für MCgesamt, 3% für MC I und 2,8% für MC II bei Konzentrationen von 400-1200 nmol/l MCgesamt. Die mittleren Wiederfindungsraten lagen in diesen Konzentrationen zwischen 88-98% für MCgesamt mit geringeren Raten bei höheren Konzentrationen. Der Inter-Assay-Variationskoeffizient betrug 10% für 401 nmol/l MCgesamt (7,5% für MC I, 14,3% für MC II).

Der Vergleich der methodischen Präzisionsparameter mit Literaturangaben zeigt eine gute Übereinstimmung für alle Methoden.

12. Die an 52 Gesunden eines mittleren Alters von 41,7 (20-83) Jahren bestimmten laborspezifischen Referenzbereiche betrugen (jeweils Mittelwert ± 2 Standard-abweichungen nach log-Transformation): HC: 5,7-15,6 µmol/l, Cys: 70-421 nmol/l, MMA: 92-301 nmol/l, MCgesamt: 81-266 nmol/l (MC I: 38-99 nmol/l, MC II: 51-140 nmol/l).

Signifikante Geschlechtsunterschiede bestanden für HC, Cys, MC I und das Alter. Die männlichen Probanden wiesen jeweils höhere Werte als die weiblichen auf, das Alter der weiblichen Kontrollpersonen war jedoch höher.

Die Referenzintervalle zeigten sehr gute Übereinstimmungen mit den in der Literatur ermittelten und belegen somit die Genauigkeit der Bestimmungsmethoden.

Die signifikanten Korrelationen (p<0,01) zwischen HC und Cys sowie zwischen MMA und MC sind als Ausdruck der Stoffwechselzusammenhänge zu werten.

Bis zu 2,4fach erhöhte HC-Werte wurden bei 88,5% der 52 untersuchten Dialysepatienten eines mittleren Alters von 53 (21-64) Jahren festgestellt. Die Konzentrationen von Cys, MMA und MC waren bei allen Patienten 5 bis 13-mal so hoch wie bei den Kontrollen. Im Einzelnen betrugen die Mittelwerte ± 2 Standardabweichungen nach log-Transformation: HC: 10,3-52,6 µmol/l, Cys: 851-6155 nmol/l, MMA: 457-1699 nmol/l, MCgesamt: 865-2036 nmol/l (MC I: 497-1063 nmol/l, MC II: 278-1208 nmol/l).

Als Ursache der signifikanten Gruppenunterschiede wurden die hochgradig eingeschränkte Nierenfunktion der Dialysepatienten mit der Folge eines funktionellen Vitaminmangels sowie eine mögliche Produkthemmung der beteiligten Enzyme aufgrund der hohen Metabolitkonzentrationen angesehen. Die Konzentrationserhöhungen sind Folge einer eingeschränkten exkretorischen wie metabolischen Nierenfunktion, woraus eine Bedeutung zur Abschätzung früher renaler Funktionsstörungen erwachsen könnte.

Bei den Dialysepatienten bestand eine signifikante Korrelation (p<0,001) zwischen HC und MMA. Dies kann Ausdruck eines Vitamin B12-Mangels sein. Es bestand eine schwache Korrelation zwischen den HC-Serumspiegeln und der Dialysedauer.

Die HC-Konzentrationen der Dialysepatienten stimmen gut mit den in der Literatur ermittelten überein. Ein Vergleich mit zwei Arbeiten, in denen auch Metabolitkonzentrationen bestimmt wurden, konnte den positiven Effekt der an unserem Zentrum durchgeführten Vitaminsubstitution belegen. Die Folsäuresubstitution könnte noch verbessert werden.

Aufgrund der verschiedenen renalen Clearanceraten, verbunden mit unterschiedlicher Dialysierbarkeit der Substanzen, wird die Beurteilbarkeit der Serumkonzentration zur Differenzierung des Vitaminmangels bei Dialysepatienten als eingeschränkt angesehen.

Zur Klärung, ob unsere Patienten tatsächlich einem höheren Risiko für atherosklerotische Gefäßveränderungen aufgrund des alterierten HC-Stoffwechsels ausgesetzt sind und ob eine intensivere Vitamintherapie die Metabolitkonzentrationen senken bzw. das kardiovaskuläre Risiko positiv beeinflussen kann, sollten weitere Studien folgen.

Die erfolgreiche Methodenetablierung, die mit einer umfangreichen Evaluierung und der praktischen Anwendung umfassend bewiesen wurde, hat die Grundlagen für weitergehende Untersuchungen geschaffen.

Inhaltsverzeichnis:

	Abbildungsverzeichnis	IV
	Tabellenverzeichnis	VI
	Abkürzungsverzeichnis	VII
1.	Einleitung	1
1.1	Homocystein	1
1.2	Homocystein-Stoffwechsel sowie Pathomechanismen der Hyperhomocysteinämie	4
1.3	Homocystein und Atherosklerose	9
1.3.1	Homocystein als Risikofaktor der Atherosklerose	9
1.3.2	Homocystein als pathogenetisches Agens der Atherosklerose	11
1.4	Homocysteinerhöhung und Vitaminstoffwechsel bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz	14
1.5	Einfluss einer Vitaminsubstitution auf die Homocystein-Konzentration	17
1.6	Homocysteinbestimmung bei anderen Erkrankungen	19
1.7	Bestimmungsmethoden	20
1.8	Referenzbereiche	22
2.	Zielstellung	23
3.	Material und Methoden	24
3.1	Material	24
3.1.1	Chemikalien und Lösungen	24
3.1.2	Geräte	25
3.2	Methoden	25
3.2.1	Probengewinnung	25
3.2.2	Probenvorbereitung	26
3.2.2.1	Probenvorbereitung zur Messung von Homocystein und Cystathionin	26
3.2.2.2	Probenvorbereitung zur Messung von Methylmalonsäure und 2-Methylzitronensäure	27
3.2.3	Messmethodik	27
3.2.3.1	Gaschromatographie-Massenspektrometrie	27
3.2.3.2	Konstante Isotopen-Verhältnisbestimmung (stable isotope dilution principle)	28
3.2.4	Messparameter	30
3.2.4.1	Messung von Homocystein und Cystathionin	30
3.2.4.2	Messung von Methylmalonsäure und 2-Methylzitronensäure	31
3.3	Entwicklung der Methodik	32
3.3.1	Ermittlung der Nachweisbarkeit und Retentionszeiten der zu messenden Substanzen	32
3.3.2	Korrektur der Konzentrationen der internen Standards	32
3.3.3	Wiederfindungsraten (recovery) der Reinsubstanzen	34
3.4	Evaluierung der Methodik	34
3.4.1	Präzision und Richtigkeit in Serumproben	34
3.4.1.1	Intra-Assay-Präzision	34
3.4.1.2	Inter-Assay-Präzision	35
3.4.1.3	Externe Evaluierung im Rahmen eines Ringversuches	35
3.5	Anwendung der Methodik	35
3.5.1	Bestimmung von Normalwerten an Gesunden	35
3.5.2	Bestimmung an Dialysepatienten	36
3.6	Statistische Verfahren	36
3.6.1	Präzision	37
3.6.2	Richtigkeit	37
3.6.3	Werte von Normalpersonen und Dialysepatienten	37
3.6.3.1	Referenzbereiche	37
3.6.3.2	Korrelationen	37
3.6.3.3	Geschlechtsunterschiede und Gruppenvergleich	37
4.	Ergebnisse	38
4.1	Retentionszeiten und Massenspektren	38
4.1.1	Homocystein	38
4.1.2	Cystathionin	40
4.1.3	Methylmalonsäure	42
4.1.4	2-Methylzitronensäure	44
4.2	Diastereomerverhältnis von 2-Methylzitronensäure-D3	47
4.3	Verunreinigungen von 2-Methylzitronensäure-D3	47
4.4	Korrekturfaktoren der Wiederfindungsraten der Reinsubstanzen	48
4.4.1	Homocystein	48
4.4.2	Cystathionin	48
4.4.3	Methylmalonsäure	49
4.4.4	2-Methylzitronensäure	49
4.5	Präzision und Richtigkeit in Serumproben	50
4.5.1	Intra-Assay-Präzision und Wiederfindung	50
4.5.1.1	Homocystein	50
4.5.1.2	Cystathionin	52
4.5.1.3	Methylmalonsäure	53
4.5.1.4	2-Methylzitronensäure	54
4.5.1.4.1	2-Methylzitronensäuregesamt	54
4.5.1.4.2	2-Methylzitronensäure II	56
4.5.1.4.3	2-Methylzitronensäure I	56
4.5.2	Inter-Assay-Präzision	57
4.5.2.1	Homocystein	57
4.5.2.2	Cystathionin	57
4.5.2.3	Methylmalonsäure	57
4.5.2.4	2-Methylzitronensäure	58
4.5.3	Externe Evaluierung der Bestimmung von Homocystein und Methylmalonsäure im Rahmen eines Ringversuches	58
4.5.3.1	Homocystein	58
4.5.3.2	Methylmalonsäure	59
4.6	Normalwerte	61
4.6.1	Referenzbereiche	61
4.6.2	Korrelationen	62
4.6.3	Geschlechtsunterschiede	63
4.7	Dialysepatienten	63
4.7.1	Werte	64
4.7.2	Korrelationen	65
4.7.3	Geschlechtsunterschiede	65
4.8	Gruppenvergleich	65
5.	Diskussion	67
5.1	Messmethodik	68
5.1.1	Homocystein-Assay	68
5.1.2	Cystathionin-Assay	70
5.1.3	Methylmalonsäure-Assay	71
5.1.4	2-Methylzitronensäure-Assay	72
5.2	Normalwerte	74
5.3	Dialysepatienten	77
6.	Zusammenfassung	84
7.	Literaturverzeichnis	86
8.	Danksagung	103
9.	Selbstständigkeitserklärung	104
	Anhang 1a und 1b
	Anhang 2a und 2b
	Anhang 3a und 3b