Enzyme der Coniferinbiosynthese in Zellkulturen von Linum album

Diplomarbeit von Bettina Schönell

Zusammenfassung:

Podophyllotoxin ist ein Pflanzeninhaltsstoff, der als Ausgangssubstanz zur Synthese der beiden wichtigen Antitumormittel Etoposid und Teniposid dient. Podophyllotoxin kann zwar chemisch synthetisiert werden, doch ist dies nicht ökonomisch. Aus diesem Grund wird Podophyllotoxin auch heute noch aus Pflanzen, insbesondere aus Podophyllum hexandrum, gewonnen. Da diese Pflanze bisher nicht erfolgreich angebaut werden kann, ist eine Sammlung aus Wildbeständen im Himalaya notwendig. Dies hat zu einer Bedrohung dieser Art, geführt, und man ist sehr an alternativen Rohstoffquellen interessiert. Eine solche Alternative wäre die Gewinnung von Podophyllotoxin mittels Zellsuspensionskulturen, z. B. mit in unserer Arbeitsgruppe vorhandenen Kulturen von Linum album, die Podophyllotoxin zu bilden vermögen.

Bisher sind unsere Kenntnisse zur Biosynthese von Podophyllotoxin, insbesondere auf enzymatischer Ebene, noch sehr unvollständig. Bekannt ist, daß über den allgemeinen Phenylpropanstoffwechsel Coniferylalkohol gebildet wird. Zwei Moleküle Coniferylakohol werden in einer oxidativen Reaktion zu (+)-Pinoresinol gekoppelt und anschließend über mehrere Schritte in Podophyllotoxin und verwandte Lignane überführt.

Im Laufe der Kulturperiode akkumuliert in den Zellkulturen von Linum album zunächst Coniferylalkohol, dessen Konzentration im weiteren verlauf der Kultivierung mit dem Anstieg der Lignane, insbesondere mit der Akkumulation von Podophyllotoxin, wieder abnimmt.

Aufgabe von Frau Schönell war es, die wichtigsten an der Biosynthese von Coniferylalkohol beteiligten Enzyme in den Zellkulturen von Linum album nachzuweisen, zu charakterisieren, ihre Aktivitäten im Kulturverlauf zu bestimmen und zum Gehalt der Zellen an Coniferylalkohol und Lignanen in Beziehung zu setzen.

Frau Schönell gelang es in kurzer Zeit, die wichtigsten an der Biosynthese des Coniferylakohols beteiligten Enzyme wie Phenylalanin Ammonium-Lyase, Zimtsäure 4-Hydroxylase, Hydroxyzimtsäure: CoA-Ligase und Zimtalkohol Dehydrogenase in den Zellen zu detektieren. Sie verifizierte die entsprechenden Reaktionsprodukte und optimierte die jeweiligen Enzymtests. Sie bestimmte die Kenndaten der untersuchten Enzyme, wie pH- und Temperaturoptima, maximale Umsatzraten und die Km-Werte für die Substrate. Diese erwiesen sich als sehr ähnlich zu denen, wie sie für die entsprechenden Enzyme aus anderen Pflanzenarten bekannt sind. Außerdem verfolgte Sie die Enzymaktivitäten über den Kulturverlauf. Es stellte sich heraus, daß die Aktivitäten dieser Enzyme sehr gut mit dem Verlauf der Akkumulation von Coniferylalkohol bzw. seines Glukosides, dem Coniferin, korrelieren. Während der Akkumulation von Lignanen wie dem Podophyllotoxin haben diese Enzyme ihre Aktivitätsmaxima überschritten. Des bedeutet, daß die untersuchten Enzyme nicht die Akkumulation der Lignane, wohl jedoch die von Coniferin kontrollieren.

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