Aufreinigung und Konzentrierung anaboler Steroide mittels der Immunoaffinitätschromatographie

Dissertation / Doktorarbeit von Marc Machnik

Einleitung:

Die in der Spurenanalytik von pharmakologisch wirksamen Substanzen eingesetzten Extraktionsverfahren reichen oft nicht aus, um die gesuchte Substanz in der biologischen Matrix (Urin, Blut, Haar, etc.) eindeutig nachzuweisen. Das liegt zum einen daran, daß die Konzentrationen dieser Substanzen äußerst gering sind und zum anderen, daß die Bioprobe eine solch komplexe Matrix bildet, daß sich Interferenzen körpereigener Stoffe bei der anschließenden gaschromatographisch-massenspektrometrischen Detektion nicht vermeiden lassen.

Durch eine besondere Aufreinigung, die Immunoaffinitätschromatographie genannt wird, sollen diese Störsubstanzen entfernt werden. Dabei macht man sich das in der Natur einzigartige Prinzip zunutze, nach dem Antikörper ihr korrespondierendes Antigen (zu analysierende Substanz) mit hoher Selektivität erkennen und reversibel binden.

Die Antikörper werden auf eine Festphase immobilisiert und anschließend mit der Probe inkubiert. Die gesuchte Substanz kann so nach dem Schlüssel-Schloß-Prinzip von den Antikörpern gebunden werden, während unspezifische Moleküle in der Bioprobe verbleiben. Nach einer Waschphase wird mittels eines organischen Solvens die Dissoziation des Antikörper-Antigen-Komplexes bewirkt und der Analyt in gereinigter Form gewonnen.

Die Herstellung von Antikörpern mit der gewünschten Spezifität (z.B. gegen anabole Steroide) wurde in dieser Arbeit durch Kopplung von Steroidhormonen an ein Protein und Immunisierung von Kaninchen mit diesen Steroid-Protein-Konjugaten ermöglicht.

Kleine Moleküle in der Größenordnung von Steroiden lösen per se keine Immunantwort und damit keine Produktion von Antikörpern aus. Erst durch die Bindung an ein großes Carriermolekül, wie z.B. Bovine Serum Albumin (BSA) oder Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH), werden sie vom Organismus als Fremdsubstanz erkannt und lösen die Antikörperproduktion aus.

Die Gruppe der 17alpha-methylierten Steroide zählt zu den am häufigsten mißbräuchlich eingenommenen Anabolika. Aufgrund ihres Metabolismus können ihre 17-Epimere länger nachgewiesen werden. Deshalb wurde für die Gewinnung der Antiseren Epimethyltestosteron-3-carboxymethyloxim hergestellt und nach der Carbodiimid-Methode an die Trägerproteine BSA und KLH gekoppelt.

Die mit diesen Antigenen in Kaninchen erzeugten Antikörper wurden auf verschiedene Festphasen aufgebracht und in spezielle Säulen gefüllt. Ihre Spezifität und Kapazität wurden bestimmt. Dabei zeigte sich, daß nur mit den KLH-Immunogenen Antikörper mit geeigneter Spezifität zu gewinnen sind und eine Verbesserung des Signal/Rausch-Verhältnisses, verglichen mit herkömmlichen Festphasenextraktionen (z.B. an Polystyrol), zu erzielen ist.

Zwei weitere Immunoaffinitätssäulen, beladen mit Anti-Methyltestosteron-Antikörpern, die aus unterschiedlichen Immunisierungsprozeduren stammten, standen zur Verfügung. Aufgrund ihrer Kreuzreaktivität konnten mit diesen Antikörpern Metenolon und auch zwei Langzeitmetabolite von Stanozolol, 3'-Hydroxy- und 4beta-Hydroxy-Stanozolol aus Urinproben isoliert werden, so daß charakteristische Massenspektren für diese Substanzen aufgezeichnet werden konnten.

Versuche, durch Herstellung von Stanozolol-4-CMO- und Stanozolol-17-CMO-Protein-Konjugaten, Antikörper mit höherer Spezifität für die Stanozololmetabolite zu erzeugen, ergaben keine Verbesserungen hinsichtlich Säulenkapazität und Abtrennung unerwünschter Begleitsubstanzen.

Einen Einfluß auf die Reinheit des Analyten hatte auch die Trägerfestphase, auf der die Antikörper gebunden waren. Von den zur Verfügung stehenden Gelfestphasen wiesen die besten Eigenschaften diejenigen mit hydrophilem Gerüst auf, wie z.B. Polysaccharidgele. Unspezifische Wechselwirkungen endogener Substanzen zur Gelmatrix wurden bei den hydrophoben Polymethacrylatphasen beobachtet. Es hat sich gezeigt, daß die IAC zur Reinigung und Isolierung anaboler Steroide am effektivsten ist, wenn die Proben vorher hydrolysiert und einer ersten Extraktion unterzogen wurden.

Die Methode der IAC läßt sich nach Gewinnung geeigneter Antikörper, die als limitierender Schritt bei der Herstellung von IAC-Sorbentien zu betrachten ist, prinzipiell auf jeden beliebigen Analyt übertragen. Sie ist daher für viele analytische Fragestellungen interessant, bei denen es darum geht, Substanzen in Spuren aus komplexen biologischen Matrizes zu isolieren.

Studien außerhalb dieser Arbeit mit Haaren und Pferdeserum haben gezeigt, daß die IAC auch für andere biologische Matrizes als Urin geeignet ist.

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