Herstellung von Fluoreszenz-markierten Arrestin-Varianten zum Funktionsnachweis rekombinanter G-Protein-gekoppelter Rezeptoren

unternommen. Getestet wurden Butyl-, Octyl- und Phenyl-Sepharose bei drei pH-Werten (7,0; 7,5; 8,0) und drei Ammoniumsulfat-Konzentrationen (1M; 1,2 M; 1,7 M) im Bindungspuffer. Das beste Ergebnis wurde mit Phenyl-Sepharose bei pH 7,0 und 1,2 M (NH4)2SO4 im Bindungspuffer erzielt.Hierzu wurden 4 g des (NH4)2SO4–Präzipitats in 50 ml HICBindungspuffer (1,2 M Ammoniumsulfat, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA, 50 mM K2HPO4 pH 7,0) gelöst, filtriert und eine Stunde bei 20 000 g zentrifugiert. Die Zunahme der Ammoniumsulfatkonzentration durch Auflösen des (NH4)2SO4–Präzipitats im Bindungspuffer wurde mittels Refraktometer auf weniger als 50 mM bestimmt und konnte daher vernachlässigt werden. 3 ml Phenyl-Sepharose wurden mit HIC-Bindungspuffer äquilibriert und mit dem Überstand beladen. Nach dem Waschen mit vier Säulenvolumen Bindungspuffer erfolgte die Elution manuell in einem Stufengradienten in 100 mM-Schritten (1,2 M -0 M (NH4)2SO4). Die Reinigung ist hier am Beispiel von Arr2-L-EYFP dokumentiert (Abb. 16). Die EGFP-Variante konnte in derselben Qualität gereinigt werden (nicht gezeigt). [...]

Ausgehend von den Erkenntnissen bei der Stammauswahl, wurden für die Expression der Fusionsproteine Bedingungen gewählt, bei denen die Expressionsrate erheblich herabgesetzt war. Neben einer deutlich niedrigeren Kultivierungstemperatur sollte eine frühe Induktion mit einer ITPG-Konzentration von 20 µM statt 1 mM zu einer erhöhten Ausbeute an löslichem Protein führen. Um dennoch bei der dann zu erwartenden geringen Gesamtausbeute eine ausreichende Menge an Protein zu erzeugen wurde eine Fed-Batch-Fermentation in einem 10 Liter-Fermenter durchgeführt (Abb. 12). Das Kulturvolumen einschließlich feeding betrug 4 l. Nach dem Animpfen mit einer 160 ml-Vorkultur wuchsen die Zellen bei 30 °C bis zu einer OD600 von 15 und es wurde mit der Zufütterung (feeding) begonnen. Bei Erreichen der OD600 von 25 wurde die Temperatur auf 4 °C abgesenkt, die Kultur durch 20 µM IPTG induziert und 38 Stunden später durch 20minütige Zentrifugation bei 5000 g geerntet. [...]

Abbildung 10: Expressionstest von Arr2-L-EGFP in BL21 und BL21 c+ M : Proteinmarker; v.I.: vor Induktion; Zeitangaben : Stunden nach Induktion Die beiden durch Pfeile gekennzeichneten Banden markieren die bereits eine Stunde nach Induktion auftretende Proteinbande bei ca. 70 kDa, dem errechneten Molekulargewicht des Fusionsproteins. Die Expression in BL21 c+ ist etwas effizienter als in BL21. Daher fiel die Wahl auf E.coli BL21 c+ als Expressionsstamm für alle weiteren Versuche. In beiden Stämmen liegt das Protein fast ausschließlich in unlöslicher Form (Abb. 11) vor. Auch eine Absenkung der Kultivierungstemperatur von 30 °C auf 25 °C (hier nicht gezeigt) führte zu keiner Verbesserung der Ausbeute. [...]