Bestimmung von androgenen und antiandrogenen Substanzen in wässrigen Umweltproben mit biologischen und chemischen Methoden

Diplomarbeit von Stefan Spathelf

Einleitung:

In den letzten Jahren häufen sich Berichte über eine Zunahme von endokrinen Störungen bei Mensch und Tier, die unter anderem auf Substanzen natürlichen und synthetischen Ursprungs mit hormoneller Wirkung zurückgeführt werden. Es handelt sich dabei im Wesentlichen um Störungen der Geschlechtsdifferenzierung und Reproduktion bei verschiedenen Tieren. Außerdem wird angenommen, dass in diesen Substanzen eine Ursache für die in den letzten Jahrzehnten beobachtete deutliche Zunahme hormonabhängiger Krebserkrankungen in den Industrieländern liegt. Auch über eine durch diese Substanzen ausgelöste Abnahme der Spermienzahl beim Menschen wird spekuliert.

Die Forschung beschränkt sich derzeit weitgehend auf Substanzen mit östrogener Aktivität. So wurden in der Umwelt zahlreiche Substanzen gefunden, die ein östrogenes Potenzial aufweisen und aus unterschiedlichsten Quellen stammen. Dabei handelt es sich um von Mensch und Tier ausgeschiedene natürliche und synthetische Östrogene, Pflanzeninhaltsstoffe sowie Industriechemikalien.

Es ist zu erwarten, dass in der Umwelt nicht nur Östrogene, sondern auch andere endokrin wirksame Substanzen eine relevante Rolle spielen. So wurden in den letzten Jahren einige nichtsteroidale Umweltchemikalien mit antiandrogener Wirkung entdeckt.

Deshalb wird in der vorliegenden Diplomarbeit eine Methode zur In-vitro-Untersuchung von wässrigen Umweltproben auf ihr androgenes und antiandrogenes Potenzial etabliert. Als Basis für diesen Zellkulturtest dient die humane Brustkrebszelllinie MCF-7 AR-1. Mit Hilfe dieser Methode werden verschiedene Einzelsubstanzen und Umweltproben auf ihr androgenes und antiandrogenes Potenzial hin untersucht.

Zur Spezifizierung und Quantifizierung von natürlichen Androgenen und deren wichtigsten Metaboliten in wässrigen Umweltproben wird ein Verfahren mittels GC/MS nach vorheriger Silylierung entwickelt und angewandt.

Zusammenfassung:

Zur Untersuchung von Substanzen und wässrigen Umweltproben auf ihr androgenes und antiandrogenes Potenzial wurde eine biologische Methode unter Verwendung von MCF-7 AR-1 Brustkrebszellen etabliert. Sie ist weitgehend spezifisch und unterliegt nur geringen Einflüssen durch Östrogene, Gestagene und Cortisol. Mit diesem Verfahren wurden die wichtigsten Testosteronmetabolite und verschiedene Substanzen, die bereits in wässrigen Umweltproben gefunden wurden, untersucht.

Die Testosteronmetabolite zeigten alle eine gewisse, unterschiedlich ausgeprägte androgene Wirkung. Daneben konnte drei Triphenylmethanderivaten eine antiandrogene Wirkung nachgewiesen werden. Bei den anderen Einzelsubstanzen war keine eindeutige Wirkung feststellbar. Anschließend wurden verschiedene Wasserproben von Flüssen und Kläranlagen untersucht. Sämtliche Proben zeigten mehr oder weniger ausgeprägte androgene oder antiandrogene Effekte oder eine Kombination aus beiden. Eine Systematik war dabei nicht erkennbar.

Daraufhin wurde eine Methode zur chemischen Bestimmung von beta-Sitosterol, Testosteron und dessen Metaboliten in obigen Proben entwickelt. Sie beruht auf einer Festphasenextraktion, anschließender Derivatisierung der Steroide zu den Trimethylsilylderivaten und Bestimmung mittels GC/MS. Die Methode eignete sich allerdings nicht zur Untersuchung der stärker verschmutzten Proben. In den auswertbaren Wasserproben konnten die Substanzen Androsteron, 5alpha-Androstane-3alpha,17beta-diol, 5beta-Dihydrotestosteron und beta-Sitosterol detektiert werden. Die Konzentrationen der Testosteronmetabolite lagen jeweils bei etwa 300 ng/l (» 1×10^9 mol/l). Die Nachweisgrenzen in den Umweltproben lagen zwischen 5,9 und 34,6 ng/l (20–119 pmol/l).

Inhaltsverzeichnis: