Konstruktion und Charakterisierung rekombinanter bispezifischer Antikörper-Fragmente zur experimentellen Therapie der Hodgkinschen Krankheit

Eine IMAC-Säule wurde mit 5 ml-Iminodiacetat-Sepharose gefüllt, mit 200 ml ddH2O gewaschen, mit etwa 20 ml einer 0,1 M Kupfersulfat-Lösung beladen, anschließend mit 300 ml ddH2O zur Entfernung von überschüssigem CuII gespült und dann mit 200 ml Dialysepuffer äquilibriert. Mit dem Dialysat der Ammoniumsulfatpräzipitation wurde die Säule beladen, mit 300 ml Dialysepuffer und 300 ml Waschpuffer gewaschen und abschließend mit Elutionspuffer mit Hilfe der FPLC-Anlage eluiert. Die Fraktionen wurden zu je 1 ml aufgefangen und anhand des Elutionsprofils im Westernblot oder im Coomassie-gefärbten SDS-PAGE analysiert. Vor Wiederverwendung der Säule wurde das CuII mit etwa 10 ml 0,1 M EDTA-Lösung entfernt, die Sepharose in ~25 ml 0,5 M NaOH-Lösung [...]

Zur Anreicherung des bsAk wurden die Proteine mit Ammoniumsulfat gefällt. Dazu wurden langsam (über 60-90 Minuten) fein zerriebenes Ammoniumsulfat (70 % der Sättigung, entsprechend 472 g/l Lösung) unter Rühren bei 4 °C zugegeben, danach wurde noch für mindestens 2 Stunden weitergerührt. Das Proteinpräzipitat wurde zentrifugiert (SLA3000, 40 Minuten, 9000 rpm und 4 °C), der Überstand verworfen, das Sediment in 0,5 Vol Dialysepuffer aufgenommen und drei mal für mindestens 4 Stunden bei 4 °C gegen Dialysepuffer dialysiert. Die Präzipitate der Dialyse wurden durch Zentrifugation (SLA3000, 4 °C, 9000 rpm, 40 Minuten) entfernt. Der Überstand wurde danach für die Beladung der IMAC-Säule zur weiteren Aufreinigung verwendet. [...]

Zur bakteriellen Expression wurden die Expressionsvektoren pSKID (bsDb) und pSKK (TandDb) verwendet. Geeignete Bakterien für die Expression sind die E.Coli Stämme XL1-Blue und RV308. Da jedoch bei RV308 im Vergleich zu XL1-Blue keine Freisetzung der Antikörper in den Überstand beobachtet werden konnte, ist der robuste und schnell wachsende Wirt RV308 optimal [Kipriyanov, 2002]. 100 ml 2YTGA (100 mM Glukose, 100 µg/ml Ampicillin) wurden mit E. Coli RV 308 angeimpft. Die Vorkultur wurde üN bei 26 °C und 180 rpm inkubiert und davon ein 4-8 l-Expressionsansatz hergestellt. Von der Vorkultur wurde so viel in 2 l 2YTGAMedium überführt, bis die OD600 0,1 betrug (zur optimalen Belüftung wurden 2l Kultur in einen 5 l-Erlenmeyerkolben gefüllt). Anschließend wurde die Kultur bei 26 °C und 180 rpm etwa 3,5 bis 4 Stunden herangezogen, bis die OD600 einen Wert von 0,6-0,8 erreichte. Die anschließende Zentrifugation erfolgte bei 8000 rpm mit dem SLA 3000-Rotor für 20 Minuten bei 20 °C und der Überstand wurde nach der Zentrifugation verworfen. Die Sedimente wurden in 1 Vol YTBS (100 µg/ml Ampicillin) resuspendiert und die Proteinexpression mit 0,2 mM IPTG induziert. Bei 21 °C und 180 rpm wurde die Kultur üN inkubiert, anschließend bei 9000 rpm (SLA 3000-Rotor, 45 Minuten, 4 °C) abzentrifugiert und das Kulturmedium dekantiert. [...]