Ermittlung der Gewebebindung von Pharmaka im Gehirn zur Abschätzung der Verfügbarkeit von 16 Wirkstoffen: In vitro Methodenvergleich von Membranaffinität und Gleichgewichtsdialyse

Diplomarbeit von Lydia Helmdach

Einleitung:

Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) ist eine seit über hundert Jahren bekannte physiologische Barriere, die den freien Austausch von Stoffen und Immunzellen zwischen Blutgefäßsystem und Gehirn kontrolliert und verhindert. Für die medikamentöse Therapie von Gehirnerkrankungen wie Morbus Alzheimer oder Tumore ist die Überwindung der Schranke eine essentielle Voraussetzung. Nur wenn der erforderliche Wirkstoff in ausreichender Konzentration am Zielrezeptor im Gehirn zur Verfügung steht, kann ein Therapieerfolg resultieren. Bedeutung erlangt sie zugleich in anderen Therapiezweigen, bei Substanzen deren Wirkungsort nicht das Hirngewebe ist, um unerwünschte Arzneimittelnebenwirkungen abschätzen und gegebenenfalls durch Substanzoptimierung vermeiden zu können. Die Entwicklung von Medikamenten zur Therapie von Erkrankungen des Zentralnervensystems (ZNS) stellt das zweitgrößte Anwendungsgebiet der pharmazeutischen Industrie dar. Bezogen auf das rationale Design neuer Wirkstoffe ergibt sich in Hinblick auf pharmakokinetische Parameter ein grundsätzliches Problem: Wegen des erheblichen experimentellen Aufwandes und der hohen Kosten werden solche Untersuchungen nur für sehr wenige Verbindungen durchgeführt. Ungünstige pharmakokinetische Eigenschaften werden somit erst in einer sehr späten Stufe erkannt, dann wenn bereits erhebliche Summen in die Entwicklung eines neuen Arzneistoffes gesteckt wurden. Mitte der 1990er-Jahre zeigten Studien, dass eine Vielzahl der erfolglosen Entwicklungsvorhaben an einer unbefriedigenden Pharmakokinetik und intolerablen Toxizität scheiterten. ZNS-Pharmaka weisen geringe Erfolgsraten von nur 8 % bei Entwicklungszeiten von 12-16 Jahren auf. Nicht-ZNS-Pharmaka hingegen haben eine 11 %ige Erfolgsrate und eine Entwicklungszeit von nur 10-12 Jahren. Diese Diskrepanz resultiert aus der enormen Komplexität des Gehirns, dem hohen Nebenwirkungspotential von zentralwirkenden Vertretern sowie der erheblichen Selektivität der BHS. Es hat sich gezeigt, dass nur 2 % bis 20 % der als Medikament geeigneten chemischen Substanzen die entsprechende Zielstruktur im Gehirn erreichen.

Nicht nur die Fähigkeit der BHS-Passage, sondern auch die Bindung an das Hirngewebe beeinflusst die Verfügbarkeit einer Substanz. Da die Gewebekomposition des Hirns neben den Proteinen zum größten Teil durch Lipide bestimmt wird, findet die unspezifische Bindung der Testsubstanz vorrangig an die Lipide statt. Daraus resultiert eine Verminderung der aktiven bzw. freien Konzentration des Wirkstoffes, wodurch auch die Interaktion mit dem Zielrezeptor erheblich eingeschränkt wird. Die Bindung an diesen Rezeptor wiederum ist essentielle Vorrausetzung für die Wirkung des Arzneimittels. Demzufolge ist es wichtig, frühzeitig zu untersuchen, ob relevante Substanzen die Blut-Hirn-Schranke passieren und ob diese auch in ausreichender Konzentration in der Interstitialflüssigkeit zur Verfügung stehen.

In den letzten Jahren wurden verschiedene Methoden zur Untersuchung des Wirkstofftransportes über die BHS sowie der unspezifischen Bindung entwickelt. Generell unterscheidet man zwischen in-vivo und in-vitro Modellen. Mit in-vivo Methoden (z.B. in-situ Perfusion oder Brain Uptake Index) ist die Bestimmung der totalen BHS-Permeabilität bzw. die Ermittlung des Einflusses von Transportmolekülen auf die BHS-Permeabilität möglich. Es handelt sich oft um sehr teure Methoden, bei denen das Versuchstier nach der Applikation der Testsubstanz in den Blutkreislauf getötet wird.

In-vitro Methoden kommen ohne Tierversuche aus. Die meisten in-vitro BHS Modelle basieren auf Kulturen isolierter Endothelzellen aus Hirnkapillaren. Außerdem sind die Gleichgewichtsdialyse gegen Hirnhomogenat (kein Tierversuch, aber Versuchstiertötung notwendig) und die Bestimmung der Membranaffinität (TRANSIL Brain Absorption Assay) etablierte in-vitro Modelle. Sie erlauben eine vorzeitige Charakterisierung der Testsubstanz in Bezug auf die Verfügbarkeit im Gehirn, wodurch die Anzahl der im Vorfeld notwendigen Versuche erheblich reduziert werden kann. Das spart nicht nur Kosten, sondern auch Zeit.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollen zwei in-vitro Methoden, zur Untersuchung der unspezifischen Bindung an Hirnlipide auf ihre Effektivität hin, verglichen werden. Zum einen soll untersucht werden, ob die Abschätzung der ungebundenen Fraktion der Testsubstanz aus der Affinitätsbestimmung zu einer Membran aus Hirnlipiden vergleichbare Ergebnisse liefert, wie die Ermittlung der Gewebebindung an Rattenhirnhomogenat durch Gleichgewichtsdialyse. Zum anderen soll ermittelt werden, ob Hirnlipide von Schlachttieren (Schwein) analoge Resultate erzielen wie derzeit in der Routine eingesetzte Hirnlipide von Ratten. Sollte dies der Fall sein, können auf der Basis dieser Untersuchungen Versuchstiertötungen in der Industrie erheblich reduziert werden.

Die Dialyse wird mit perfundiertem und unperfundiertem Rattenhirnhomogenat durchgeführt. Beide Homogenate enthalten Gewebeproteine, Hirnlipide sowie unterschiedliche Anteile an Kapillarblut. Aus diesem Grund sollen die Plasmaproteinbindung, die Gewebealbuminbindung und die Kapillarblutmenge im Rattenhirn bestimmt werden. Sollte der Einfluss des in den Kapillaren verbliebenen Bluts sowie der Testsubstanzbindung an Gewebealbumin hoch sein, so hätte dies entscheidende Konsequenzen für die Wahl des Tiermodells zur Abschätzung der Gewebebindung im Gehirn. Die Ermittlung des Trockensubstanzgehaltes sowie des Protein- und des Lipidgehalts im eingesetzten Rattenhirn geben Aufschluss über die Zusammensetzung und ermöglichen eine genauere Interpretation der Messergebnisse.

Inhaltsverzeichnis:

Textprobe:

Kapitel 3, Experimenteller Teil:

TRANSIL Technologie: Die TRANSIL Technologie basiert auf modifizierten Silicakugeln mit spezieller Oberflächenchemie.

Bestimmung der Membranaffinität: Die Bestimmung der Membranpermeabilität erfolgt mit dem TRANSIL Brain Absorption Assay.

Prinzip: Die TRANSIL Brain Absorption Assay Platten enthalten in Puffer (PBS Puffer: 10mmol/l Phosphatpuffer mit 150mmol/l NaCl, pH 7,4) suspendierte Silicakugeln. Diese sind, wie in Abbildung 1 dargestellt, oberflächlich mit Hirnlipiden von Schlachttieren (Schweine) durch nichtkovalente Bindung beschichtet. Typische Lipidmoleküle die eingesetzt werden sind Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylserin (PS), Phosphatidylcholin (PC), Phosphatidsäure (PA) und Phosphatidylinositol (PI). Der aufgebrachte Bilayer aus amphiphilen Lipiden enthält hydrophile Kopfgruppen, die der wässrigen Seite zugewandt sind. Die lipophilen Molekülteile der beiden Lipidschichten (Monolayer) zeigen aufeinander und bilden den hydrophoben Innenbereich der Membran. Mit dieser Technik entsteht eine bei Raumtemperatur flüssige Membran, welche die natürliche Permeabilitätsbarriere der Gehirnzellen bei physiologischen pH-Wert von 7,4 und Körpertemperatur nachahmt. Das Reaktionsprinzip beruht auf der reversiblen Anlagerung (Adsorption) von chemischen Molekülen bekannter Konzentration (Testsubstanz) an die Lipiddoppelschicht der TRANSIL - Silicakugeln. Die Reaktion findet bei unterschiedlicher definierter Lipidkonzentration statt, d.h. die Testsubstanz wird in 6 Reaktionsgefäßen mit jeweils unterschiedlicher Anzahl Lipid-beschichteter Kugeln inkubiert. Reaktionskammer 1 und 8 dienen als Referenzwert und enthalten lediglich Testsubstanz und Puffer (ohne Lipid). Zentrifugation beschleunigt die Phasentrennung zwischen beschichteten Siliciumdioxidkugeln (Adsorbens) und wässrigem Puffermedium. Im Überstand kann darauffolgend die freie, nicht adsorbierte Konzentration der Testsubstanz (cbuffer) mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-Kopplung (LC/MS/MS) bestimmt werden. Mit der ermittelten Konzentration cbuffer wird die Konstante logMABrain berechnet. Diese Konstante bezieht sich auf den Logarithmus der Affinität zur Gehirnmembran und kennzeichnet den Verteilungskoeffizienten zwischen Lipid- und Pufferphase. Mit Hilfe der ermittelten Membranaffinität ist wiederum eine Vorausberechnung der freien Fraktion des Pharmazeutikums im Gehirn möglich (Abbildung 1: Illustration einer TRANSIL Brain Absorption Silicakugel beschichtet mit Hirnlipiden vom Schwein. Die hydrophilen Kopfgruppen der Lipidschichten sind der wässrigen Seite zugewandt. Die lipophilen Molekülteile zeigen aufeinander und bilden den hydrophoben Innenbereich der Membran).