Charakterisierung der mikrobiellen Biozönose im Sediment und Freiwasser der Talsperre Saidenbach

Diplomarbeit von René Kaden

Einleitung:

Kapitel 1.1, Ökologie von Talsperren:

Talsperren dienen hauptsächlich der Trinkwasserversorgung, der Energiegewinnung und dem Hochwasserschutz. Allerdings bedingen sie auch, daß weltweit 20 Prozent der jährlichen Sedimentfracht der Flüsse zurückgehalten wird. Das entspricht 2-5 x 109 metrischen Tonnen Sediment, welche die Weltmeere nicht erreichen. Außerdem führen Talsperren zu einer Unterbrechung von Fluß-Ökosystemen, was auf Fische einen enormen Einfluß hat. So erreichen wandernde Fische ohne extra angelegte Fischtreppen ihre Laichplätze nicht mehr. Außerdem entspricht die Wasserbeschaffenheit nach einer Talsperre nie der, die der Fluß ohne das Bauwerk aufweisen würde. Allerdings stellen Talsperren auch einen neuen Lebensraum für Spezies dar, welche sich nicht in Flüssen ansiedeln würden und führten so zur Entstehung völlig neuer Ökosysteme. Diese werden maßgeblich durch die Verfügbarkeit der Nährstoffe, welche entweder allochthonen oder autochthonen Ursprungs sein können, beeinflußt.

Unter Nährstoffen versteht man neben organisch gebundenem Kohlenstoff insbesondere Phosphor- und Stickstoffverbindungen. Letztere werden neben dem Eintrag durch die Landwirtschaft aus dem Boden ausgespült, wo im Frühjahr die Mineralisierungsrate durch Ammonifikation und folgende Nitrifikation steigt. In saurer Nadelstreu, welche im Einzugsgebiet der untersuchten Talsperre Saidenbach als Auflage dominiert, erreicht die Mineralisierung bei 20 Grad Celsius ein Optimum. Die Nitrifikation wird nicht durch NH3-Mangel begrenzt, da die Ammonifikationsrate in Nadelstreuauflagen stets höher ist als die Nitrifikationsrate. Mittels des Gehaltes an Phosphor können Gewässer einer Trophiestufe zugeordnet werden. So wurden nach einer Empfehlung von CARLSON, die in Tabelle 1.1 aufgeführten Trophiegrade festgelegt.

Die Bestimmung des Trophiegrades eines Gewässers erfolgt zur Frühjahrsvollzirkulation, da sich der Nährstoffgehalt im Jahresverlauf ändert. So führt zum Beispiel der Nährstoffreichtum des Gewässers im Frühjahr zu einer Massenentwicklung von Diatomeen. Diese entwickeln sich bis zur Sommerstagnation und sedimentieren nach dem Absterben aufgrund ihrer relativ hohen Dichte, welche durch ihre Kieselsäurehüllen bedingt ist. Dabei wird der in den Bakterien gebundene Phosphor temporär im Sediment abgelagert.

Häufig liegt Phosphat im Sediment an dreiwertige Eisenionen gebunden vor. Herrschen dort anoxische Verhältnisse, bedingt das niedrige Redoxpotential eine Eisensulfidbildung unter Freisetzung der Phosphationen, was zur Eutrophierung führt. Daher sollte der Nitratgehalt des Sedimentes nicht zu stark absinken.

Für die Verteilung von Nährstoffen bzw. von Mikroorganismen, die einen großen Teil davon umsetzen, ist unter anderem die Vollzirkulation eines Gewässers von Bedeutung. Beeinflußt wird dieses Ereignis maßgeblich durch die sich ändernde Dichte des Wassers bei Temperaturänderung, das Verhältnis zwischen Tiefe und Oberfläche des Gewässers sowie die Schergeschwindigkeit von Luftströmungen. Viele Talsperren sind aufgrund ihrer relativ großen Oberfläche und geringen Tiefe dimiktisch. Das bedeutet, daß eine Frühjahrs- und Herbstvollzirkulation stattfindet. Diese Prozesse führen dazu, daß nicht nur die Nährstoffe verteilt werden, sondern auch Habitate zerstört und viele neue ökologische Nischen geschaffen werden. Die Intermediate Disturbance Hypothesis besagt, daß sich direkt nach massiven Störungen eines Ökosystems mehr Arten ansiedeln als vor dem Ereignis. Diese Störungen müssen in zeitlichen Intervallen erfolgen, in denen die Organismen sich nicht nur ansiedeln, sondern auch anpassen können. Nach der Vollzirkulation ist demnach auch eine größere Artenzahl an Organismen im Wasser zu erwarten.

Neben den abiotischen Faktoren haben auch die biotischen einen großen Einfuß auf ein Ökosystem. Die Vielfalt an Interaktionen zwischen den unzähligen Lebewesen ist außerordentlich groß. So existieren unter anderem neben symbiontischen oder kommensalischen auch parasitäre oder Räuber-Beute-Beziehungen. Letztere werden durch den Fraßdruck (top-down) bzw. Beutemangel (bottom-up) reguliert. So kann ein Ökosystem nur funktionieren, wenn wenigstens die untersten trophischen Ebenen verfügbar sind. Das sind bezogen auf die Talsperren die Produzenten, welche aufgrund ihrer autotrophen Lebensweise anorganische in organische Biomasse umwandeln, sowie die heterotrophen Primär- bzw. Sekundärkonsumenten. Überaus wichtig für ein Ökosystem sind auch die Destruenten, welche durch Mineralisation organischen Materials Nährelemente in den Kreislauf zurückführen. Diese Leistung wird vor allem von Bakterien, welche in allen Bereichen der Talsperre vorkommen, vollbracht. Diese können entweder frei suspendiert, an anorganischem Material oder als Aggregation z.B. in Biofilmen vorkommen. Die Mikroorganismen können neben ihrer Aufgabe als terminale Zersetzer jedoch auch als Produzenten ganz am Anfang der Nahrungskette stehen. Ein Beispiel dafür sind die photoautotroph lebenden Cyanobakterien. Da der größte Teil der Bakterienspezies noch nicht bekannt ist, lassen sich keine endgültigen Aussagen über die Gesamtheit der mikrobiellen Interaktionen treffen. Um diese Wechselbeziehungen zu erforschen, bedarf es einer Kultivierung der Bakterien. Das ist jedoch, in Abhängigkeit vom Habitat der Mikroorganismen bisher nur bei 0,001 Prozent bis 15 Prozent der Spezies gelungen. Aus dem Wasser mesotropher Seen konnten nur 0,1 bis 1 Prozent der Bakterien kultiviert werden.

Inhaltsverzeichnis:

	Inhaltsverzeichnis	I
	Abkürzungsverzeichnis	III
1	Einleitung	1
1.1	Ökologie von Talsperren	1
1.2	Die Talsperre Saidenbach	3
1.3	Aspekte der Trinkwasseraufarbeitung	6
1.4	Mikrobielle Biozönose	7
1.4.1	Phagen	8
1.4.2	Mycobakterien	11
1.5	Zielstellung	13
2	Material und Methoden	14
2.1	Bakterienstämme, Phage, Plasmid	14
2.2	Nährmedien	15
2.2.1	Nährmedium zur Anzucht von E. coli bei der Klonierung	15
2.2.2	Nährmedien zur Untersuchung biochemischer Stoffwechselleistungen	16
2.2.3	Mycobakterien-Kultivierung	22
2.2.4	Medien zur Phagen-Untersuchung	23
2.3	Probenahme und Abtrennung	24
2.4	Molekularbiologische Methoden	27
2.4.1	DNA-Extraktion	27
2.4.1.1	Fast DNA® Spin for Soil (Q Biogene)	27
2.4.1.2	Bead Beater- Aufschluß	28
2.4.1.3	QIAamp® DNA-Stool Mini Kit (Qiagen 2001)	28
2.4.1.4	QIAamp® DNA Blood Mini Kit (Qiagen 2003)	28
2.4.2	Polymerase Chain Reaction (PCR)	28
2.4.2.1	Primer	29
2.4.2.2	PCR-Programme	30
2.4.3	Gelelektrophorese und DNA-Detektion	30
2.4.4	DNA-Extraktion aus Agarosegel	31
2.4.5	Klonierung (Invitrogen 2004)	32
2.4.6	Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP)	33
2.4.7	Sequenzierung	33
2.4.7.1	Aufreinigung der Proben für die Sequenzier-PCR	34
2.4.7.2	Sequenzier-PCR	34
2.4.7.3	Aufreinigung der Proben für die Sequenzierung	34
2.4.7.4	Sequenzierung	35
2.4.8	Datenbank NCBI Blast	35
2.4.9	Catalyzed reporter deposition fluoreszenz in-situ Hybridisierung	36
2.4.9.1	Puffer und Lösungen für CARD FISH	36
2.4.9.2	Fixierung und Lysozym-Behandlung	37
2.4.9.3	Hybridisierung und Sonden	38
2.4.9.4	Fluoreszenzmikroskopie	40
2.5	Bakteriophagen-Plaquetest	41
2.5.1	Phagenextraktion	41
2.5.2	Somatische Coliphagen	41
2.5.3	F-spezifische Bakteriophagen	43
2.6	Kultivierung und Bestimmung von Mikroorganismen	44
2.6.1	Bakterienkultur auf Wassermedium	44
2.6.2	BIOLOG	45
2.6.2.1	Biolog Sedimentproben	45
2.6.2.2	Biolog Reinkulturen	46
2.6.3	Mycobakterien	47
2.6.3.1	Mycobakterien-Kultur	47
2.6.3.2	Färbemethoden für Mycobakterien	48
2.6.3.3	Identifizierung von Mycobakterien	49
2.6.4	Rasterelektronenmikroskopie	50
3	Ergebnisse und Diskussion	51
3.1	Phagenuntersuchung	51
3.2	CARD-FISH	55
3.2.1	Vergleich kumulative Berechnung vs. Einzelwertbetrachtung	55
3.2.2	Vergleich ALF1b mit ALF968	56
3.2.3	Allgemeine Verteilung der Bakteriengruppen	59
3.2.4	Jahreszeitliche Betrachtung der Bakteriengruppen im Sediment	62
3.2.5	Auftreten der Bakteriengruppen 2005 und 2006	64
3.2.6	Tiefenprofilabhängige Verteilung der Bakterien im Sediment	65
3.3	Allgemeine 16S-Klonierung und Sequenzierung	69
3.3.1	Artenspektrum	72
3.3.2	Jahreszeitlicher Vergleich	73
3.3.3	Vergleich Pelagial und Sediment	76
3.3.4	Besonderheiten der Proben der Vorsperre Forchheim	76
3.4	Vergleich der Ergebnisse von CARD FISH und Klonierung	77
3.5	Untersuchung bakterieller Stoffwechselleistungen mittels BIOLOG	80
3.5.1	Average Well Color Development (AWCD)	80
3.5.2	Vergleich der Proben	81
3.6	Wassermedium Kulturen	85
3.6.1	Charakterisierung der Kulturen auf Wassermedium	85
3.6.1.1	Koloniemorphologie	85
3.6.1.2	Gruppierung anhand von Restriktionsmustern	87
3.6.1.3	Sequenzierung	88
3.6.2	Charakterisierung einer neuen Spezies	92
3.6.2.1	Molekularbiologische Untersuchung	92
3.6.2.2	Physiologische Parameter	94
3.6.2.3	BIOLOG	95
3.6.2.4	Durchlichtmikroskopie	96
3.6.2.5	Rasterelektronenmikroskopie	96
3.6.3	Abgrenzung der neuen Spezies von bekannten Arten	97
3.7	Mycobakterien	99
3.7.1	Mycobakterien PCR	99
3.7.1.1	Vergleich verschiedener DNA-Extraktionsmethoden	99
3.7.1.2	Primervergleich	99
3.7.1.3	Mycobakterien im Sediment – Nachweis mittels PCR	100
3.7.2	Mycobakterien RFLP und Sequenzierung	100
3.7.5	Mycobakterien-Kultur	104
	Zusammenfassung	107
	Tabellenanhang	109
	Literatur	138
	Internetquellen und Datenbanken	146

Textprobe:

Kapitel 3.3.3, Vergleich Pelagial und Sediment:

Betrachtet man die relativen Häufigkeiten der nachgewiesenen Klassen in der Sedimentfalle und im ersten Horizont von E der Proben vom September 2005, stellt man fest, daß den Erwartungen entsprechend die Bakterienklassen, deren Arten hauptsächlich im Pelagial leben, in größeren Mengen in E0 nachgewiesen werden konnten. Dies trifft insbesondere für einen Teil der Arten der Alpha Proteobacteria sowie uneingeschränkt für Cyanobacteria und Verrucomicrobiae zu. Klassen, welche nicht in der Sedimentfalle gefunden wurden, hatten entweder ihre pelagiale Massenentwicklung abgeschlossen oder kommen ausschließlich im Sediment vor. Das wurde bei den durchgeführten Untersuchungen bei den Klassen der Beta Proteobacteria, Chloroflexi und den Acidobacteria beobachtet.

Die mittels Klonierung häufig nachgewiesenen Chloroflexi spp. besitzen Bakterienchlorophyll a und c. Sie leben photoautotroph bzw. im Sediment chemoorganotroph. Die filamentösen, gramnegativen Stäbchen erreichen Längen von 6 Mikrometer und bewegen sich durch Gleiten fort. Die einzig beschriebene Art dieser Klasse, das orangefarbene Bakterium Chloroflexus aurantiacus, hat ein Temperaturoptimum von 52 Grad Celsius bis 60 Grad Celsius, deren mesophile Varietät eines von 20 Grad Celsius bis 25 Grad Celsius. Daher kann von einem natürlichen Vorkommen von Chloroflexus aurantiacus im Sediment von E1 ausgegangen werden.

Besonderheiten der Proben der Vorsperre Forchheim:

Von der Probenahmestelle F wurde der erste Horizont der Schichtung vom August 2006 untersucht. Da vom gleichen Monat keine DNA vergleichbarer Horizonte von E kloniert wurde, soll die Probe im Folgenden einzeln betrachtet werden. Da das Gewässer an der Probenahmestelle F eine Tiefe von nur 6 Metern aufweist und viele organische sowie anorganische Schwebstoffe vorhanden sind, finden Sedimentationsprozesse in größerem Umfang statt. Es konnte 16S rRNA der Klassen Cyanobacteria, Alpha Proteobacteria, Actinobacteria, Sphingobacteria und Chloroflexi nachgewiesen werden.

Nicht kloniert wurde DNA von Flavobakterien, welche im Pelagial im April noch vorhanden waren (s. Kap. 3.6). In der Vorsperre Forchheim ist der Eintrag von Biomasse so stark, daß eine sehr hohe Sedimentationsrate erreicht wird (UHLMANN 2001). Nach einer Massenentwicklung von Flavobakterien im Frühjahr bzw. Frühsommer wurden die wenigen sedimentierenden Bakterien, welche nicht gefressen wurden (vgl. Kap. 3.2.2), vermutlich relativ schnell im Sediment abgebaut.

In größeren Mengen wurde die 16S rRNA von Cyanobakterien kloniert. Diese Klasse zeigt im Sommer bis Spätsommer üblicherweise eine Massenentwicklung, was die Ergebnisse (s. Tab. 3.9) belegen.

Mit 12,5 Prozent relativer Häufigkeit in Bezug zur Gesamtklonzahl waren die Actinobacteria nach den Cyanobakterien die zweithäufigste nachgewiesene Klasse im August 2006 in F1.Viele Spezies dieser Klasse leben im Boden, so daß eine Ausschwemmung mit folgendem Eintrag in die Vorsperre Forchheim anzunehmen ist.

Die 16S rRNA von Alpha Proteobakterien und Chloroflexi wurde in F1 mit jeweils 10,4 Prozent nachgewiesen. Diese beiden Klassen sind in aquatischen Lebensräumen Mitteleuropas in großer Artenzahl und Abundanz zu finden.

Eine Fehlerquelle bei der Auswertung sämtlicher hier betrachteten Ergebnisse stellt der geringe Stichprobenumfang dar. So wurden pro Horizont maximal 50 Klone untersucht. Betrachtet man die große Artenanzahl, die je Gramm Sediment nachgewiesen werden kann, kommt man zu dem Schluß, daß die Untersuchung als Stichprobe und keinesfalls als statistische Erhebung interpretiert werden darf. Man kann davon ausgehen, daß Arten, deren DNA häufiger nachgewiesen wurde, auch wirklich im Bereich der Probenahmestelle vorkommen, Spezies, welche in geringer Zahl nachgewiesen wurden, jedoch auch allochthonen Ursprunges sein könnten. Außerdem wurde mittels der der Klonierung vorausgehenden PCR eine Selektion zugunsten der Arten getroffen, deren 16S rRNA mit der Primerkombination TPU1-1387R amplifiziert werden konnte. Nicht alle Bakterien weisen diese Primerbindungsstelle auf. Da die bei dieser PCR amplifizierten Fragmente diverser Spezies auch verschiedene Längen aufweisen können, werden sie bei der Klonierung mit unterschiedlicher Effizienz in das Plasmid inseriert.