Charakterisierung des Hämocyanins von Haliotis rubra

Bachelorarbeit von Mark Laible

Einleitung:

Hämocyanine:

Hämocyanin ist das respiratorische Protein vieler Arthropoden und Mollusken. Obwohl die Arthropoden- und Mollusken-Hämocyanine den gleichen Namen tragen, und es sich bei beiden um extrazelluläre Kupferproteine handelt, sind sie nicht nah miteinander verwandt. Vielmehr weisen die Arthropoden- und Mollusken-Hämocyanine grundlegende Unterschiede in der Primär-, Tertiär- und Quartärstruktur auf und werden unterschiedlichen Protein-Superfamilien zugeordnet. Das Arthropoden-Hämocyanin besteht aus bohnenförmigen Untereinheiten zu je ca. 75kDa und liegt je nach Tierart als würfelförmiges Hexamer oder Multihexamer (bis zu 12x6) vor. Das Hämocyanin der Mollusken dagegen hat die Form eines Hohlzylinders und besteht aus einer oder mehreren dekameren Grundeinheiten.

In meiner Arbeit untersuchte ich das Hämocyanin der marinen Schnecke Haliotis rubra aus der Ordnung Archeogastropoda und der Familie Haliotidae. Deswegen soll hier nur auf die Mollusken-Hämocyanine näher eingegangen werden.

Mollusken-Hämocyanine:

Mollusken-Hämocyanine werden schon seit langem eingehend untersucht. Somit sind auch deren Aufbau und Funktion schon gut erforscht. Seinen Namen verdankt das Hämocyanin Léon Fredericq. Dieser isolierte im Jahre 1878 das blaue Pigment aus dem Blut eines Tintenfisches und taufte es aufgrund seines Vorkommens im Blut und seiner blauen Farbe, Hämocyanin (Blutblau). Seine Untersuchungen ergaben, dass es sich dabei um ein Protein handelt, dass Sauerstoff transportiert.

Mit einem Durchmesser von 35nm und einer Höhe von 18nm erreichen die Mollusken-Hämocyanine die Größe eines mittelgroßen Virus und sind damit die größten respiratorischen Proteine, die in der Natur vorkommen. Der Grundbaustein der Mollusken-Hämocyanine hat die Form eines Hohlzylinders und ist aus 10 immunologisch identischen Untereinheiten (Polypeptidketten) aufgebaut, wobei sich immer 2 Untereinheiten antiparallel zu Dimeren zusammenlagern. Die Untereinheit des Hämocyanins besitzt eine Molekularmasse von ca. 350-400kDa und besteht wiederum je nach Tierklasse aus sieben oder acht globulären, funktionellen Domänen (functional units, FUs), die immunologisch sehr unterschiedlich sind. Vom N-Terminus zum C-Terminus werden die durch Linker-Regionen von ca. 10-15 Aminosäuren perlenschnurartig miteinander verknüpften FUs als FU-a bis FU-g bzw. FU-h bezeichnet. FU a-f bilden dabei im Dekamer die Wand des Hohlzylinders, FU-g und h bilden zusammen eine nach innen gerichtete Kragenregion, die bei Cephalopoden zentral, bei Gastropoden, Polyplacophoren und Bivalviern randständig auf nur einer Seite lokalisiert ist. Jede FU besitzt die Fähigkeit jeweils ein Molekül O2 reversibel zu binden. Die Bindung des Sauerstoffs erfolgt an die Cu-Atome des aktiven Zentrums der jeweiligen FU. In jedem aktiven Zentrum sind zwei Cu-Atome enthalten, von denen jedes durch drei Histidinreste koordinativ gebunden ist. Hämocyanin, das Sauerstoff gebunden hat, besitzt eine charakteristische blaue Färbung, die bei Verlust des Sauerstoffs auch wieder verschwindet.

Dadurch dass jede FU ein Molekül O2 binden kann, kann ein Dekamer 80 Moleküle O2 binden. Die Tatsache, dass das Hämocyanin ein extrazelluläres Protein ist, macht diese hohe Sauerstofftransportkapazität nötig, um den kolloidosmotischen Druck der Hämolymphe niedrig zu halten. Eine weitere Zusammenlagerung zu Multidekameren oder Clustern ist wohl auch ein Mechanismus um diesen nur von der Teilchenzahl abhängigen Druck in Grenzen zu halten.

Ziel der Arbeit:

Im Rahmen dieser Bachelorarbeit sollte das Hämocyanin von Haliotis rubra, das bisher noch nicht untersucht wurde, charakterisiert werden. Dabei sollte unter anderem das Vorkommen verschiedener Isoformen, deren Aggregationsformen und Domänenstruktur untersucht werden. Die gewonnenen Erkenntnisse sollten dann mit der nah verwandten Schnecke Haliotis tuberculata verglichen werden, deren Hämocyanin schon gut charakterisiert ist. Die hauptsächlich verwendeten Methoden waren PAGE, Elektronenmikroskopie, HPLC und zweidimensionale-Immunelektrophorese.

Inhaltsverzeichnis:

Textprobe:

Kapitel 4, DISKUSSION:

Charakterisierung der Isoformen HrH1 und HrH2:

Das Hämocyanin der Meeresschnecke Haliotis rubra (HrH) enthält zwei Typen immunologisch unterschiedlicher Untereinheiten. Diese bilden nur Homooligomere und somit auch nur zwei Typen von Oligomeren. Dieses Verhalten wurde auch für das KLH und das HtH beobachtet. Die Trennung von Gesamt-HrH mittels Anionenaustauschchromatographie (Elution mit einem Stufengradient (0,2 M NaCl, 0,4 M NaCl)) ergab drei distinkte Proteinfraktionen, die nacheinander eluierten. Die ersten zwei Proteinfraktionen (Peak 1 und Peak 2) enthielten dabei das HrH1, die letzte Fraktion (Peak 3) das HrH2. Dies konnte mit nativer PAGE und zweidimensionaler Immunelektrophorese nachgewiesen werden. Eine Kreuzreaktion zwischen dem HrH1 und dem HrH2 wie sie beim HtH beobachtet wurde, trat beim HrH nicht auf. Allerdings ist auch zu beachten, dass für alle Immunelektrophoresen HtH-Antiserum, und somit artfremdes Antiserum, verwendet wurde. Es konnte ein Anteil von 87% HrH1 und 13% HrH2 in der verwendeten Hämolymphe ermittelt werden. Bei HtH war das Verhältnis von HtH1 zu HtH2 ca. 3 : 1. Das in dieser Arbeit ermittelte 9 : 1 Verhältnis von HrH1 zu HrH2 müsste recht gut die Verhältnisse in der Natur widerspiegeln, denn zur Gewinnung des HrH wurden frisch gefangene Schnecken verwendet.

Die Benennung der Subtypen ist in Einklang mit der von KLH und HtH, denn auch hier liefen die Untereinheiten von Isoform 2 in der nativen PAGE weiter anodisch als die der Isoform 1. Unter denaturierenden und reduzierenden Bedingungen liefen das HrH1 und HrH2 auf etwa gleicher Höhe mit dem KLH, welches als Molekulargewichtsmarker diente. Somit besitzt das HrH ein Molekulargewicht von ca. 390000, wie das von KLH. Das Molekulargewicht von HtH wurde 1994 von Keller mit 370000 angegeben. Bei den von mir aufgetragenen Proteinmengen (10 Mikrogramm) ließen sich aber solche Unterschiede im Molekulargewicht wie zwischen dem KLH und dem HtH nicht feststellen.

Durch zweidimensionale Gelelektrophorese konnte gezeigt werden, dass sich HrH1 im isoelektrischen Punkt (IEP) von HrH2 unterscheidet. Für HrH1 konnte ein IEP zwischen 6,1 und 6,4, für HrH2 ein IEP zwischen 5,8 und 6,1 ermittelt werden. Auch die von Söhngen für die beiden Isoformen des KLH ermittelten isoelektrischen Punkte zeigten Unterschiede. Damals wurde für das KLH1 ein IEP von 5,8, für das KLH2 ein IEP von 5,4 ermittelt. Der IEP des Subtyps 2 war also für das KLH wie für das HrH jeweils saurer als der IEP des Subtyps 1. Die Ungenauigkeit die bei der isoelektrischen Fokussierung (IEF) auftrat, war auch bei Söhngen bei der IEF des KLH aufgetreten. Zur Steigerung der Genauigkeit der IEF könnte eine stärkere Denaturierung des Hämocyanins vor der IEF (z.B. durch Hitze), eine geringere Probenmenge bzw. ein geringer vernetztes pH-Gradientengel verwendet werden.

Warum das Gesamt-HrH in drei Fraktionen von der Anionentauschersäule eluierte, obwohl es nur aus zwei Isoformen bestand, ist nicht klar. Zum Ende der Untersuchungen wurde nochmals eine Aufreinigung von Gesamt-HrH versucht, die aber diesmal nur zwei Peaks lieferte, von denen sich der erste als HrH1 und der zweite als HrH2 erwies. Peak 1 aus den vorangegangen Aufreinigungen war fast verschwunden. Anhand der Flächen unter den Peaks konnte wieder ein Anteil von 87% HrH1 und 13% HrH2 bestimmt werden. Somit war klar, dass Peak 1 und Peak 2 aus den ersten HPLC-Auftrennungen von Gesamt-HrH zu einem Peak verschmolzen waren, und es sich bei den Proteinen aus beiden Peaks um dasselbe Protein, nämlich HrH1, handelte. Durch die Lagerung über zwei Monate bei 4°C hatte sich das Material also so verändert, dass Peak 1 bei Auftrennung durch HPLC-Anionenaustauschchromatographie verschwand.

Elektronenmikroskopische Analysen:

Bei den Untersuchungen des HrH unter dem Elektronenmikroskop erschien das Hämocyanin aus Peak 1 und 2 (HrH1) als solitäre Didekamere während das Hämocyanin aus Peak 3 (HrH2) auch lange Multidekamere bildete, wie es auch beim KLH2 beobachtet wurde. Beim HtH2 konnte im Gegensatz dazu nur die Bildung von Tridekameren beobachtet werden. Längere Multidekamere wurden bei HtH nicht gesehen. Allerdings wurde schon am KLH beobachtet, dass sich durch Lagerung in z.B. Stabilisierungspuffer lange Multidekamere gebildet haben, obwohl sie in der frischen Hämolymphe in dieser Länge nicht zu beobachten waren. Um eine Aussage über die natürliche Aggregationsform des HrH2 zu treffen, bedarf es also Untersuchungen von frischer Hämolymphe.

Die Tatsache, dass das HrH in drei Fraktionen eluierte, konnte auch anhand der EM-Bilder nicht erklärt werden. In Peak 1 wurden z.B. keine größeren Mengen von Didekamerclustern gefunden, die das frühzeitige Eluieren dieser Fraktion wegen eines Gelfiltrationsverhaltens der Anionentauschersäule hätten erklären können. Es wurden nur sehr vereinzelt solche möglichen Cluster gefunden, die allerdings in Peak 2 in gleicher Konzentration enthalten waren.