Die Bedeutung der Deubiquitinierung für den intrazellulären Transport von Membranproteinen und bei Signaltransduktionswegen

Diplomarbeit von Andreas Kesseler

Einleitung:

Die Ubiquitinierung von Molekülen kann durch Deubiquitinasen rückgängig gemacht werden, die Ub von modifizierten Protein abspalten und somit deren Aktivität und Stabilität sicherstellen. Ungeachtet dessen, dass die Enzyme des Ub-Systems schon sehr ausführlich untersucht worden sind, ist weiterhin wenig über die Art und Weise bekannt, wie die Deubiquitinasen funktionell reguliert werden.

Das Ziel des ersten Teils dieser Arbeit war es, die wechselseitigen Regulationswege der Deubiquitinasen und des NF-KB-Signalweges herauszustellen und die Mechanismen zu erörtern, über die die Enzyme in ihrer Funktionalität reguliert werden.

Das Ziel des zweiten Teiles war es, den Einfluss und die genauen Funktionen der DUBs bei der Herunterregulation des EGF-Rezeptors darzulegen.

Inhaltsverzeichnis:

Textprobe:

Kapitel 2.5, Nachweis der Regulation durch die Deubiquitinase A20:

A20 (auch: TNFAIP3) wurde 1990 ursprünglich als Inhibitor von TNF-induzierter Apoptose identifiziert. A20 ist an der Entwicklung der regulatorischen T-Zellen und an der Anti-Tumor-Reaktion beteiligt. Das A20-Protein besteht aus 790 AS und besitzt eine N-terminale OTU-Domäne sowie sieben ZnF-Domänen am C-Terminus. Während erstere für die Deubiquitinierung von Substraten verantwortlich sind, fungieren die Znf-Domänen als E3-Ligase, welche u.a. an Ubc-Enzyme binden, um Lys48-Ketten aufzubauen. Zudem besitzen die ZnF-Domänen selbst Ub-Bindungs-aktivität und sind an der Oligomerisierung von A20 beteiligt. Das bedeutet, dass A20 ein Enzym mit dualer Funktion ist, welches seine Substrate sowohl ubiquitiniert, als auch deubiquitiniert. Diese Doppelfunktion ist von Bedeutung bei der Herunterregulation des NF-KB-Signalweges. Nachdem EVANS et al. aufzeigen konnten, dass A20 Lys48- und Lys63-Ketten in vitro und in vivo von Molekülen deubiquitinieren kann, fanden WERTZ et al. heraus, dass es Lys63-Ketten vom RIP entfernt. Aktuelle Studien bestätigen, dass A20 das regulatorische TAX1-bindende Protein1 (TAX1BP1), den A20-binding Inhibitor of NF-KB-1 (ABIN-1) sowie die Ub-Ligase Itch für seine Aktivität benötigt und die drei Komponenten zusammen einen Komplex bilden. Während TAX1BP1 als Ub-Bindungsfaktor dient und A20 zu seinen Substraten rekrutiert, könnte Itch die Lys48-Ubiquitinierung von A20-Substraten wie RIP übernehmen. Bestätigt wird dies dadurch, dass ein TAX1BP1-Knockdown die A20-Bindung an RIP aufhebt. Weiterhin könnte auch das Ringfinger-Protein 11 (Rnf11), welches Ligaseaktivität besitzt zu dem Komplex gehören. A20 fungiert also in einem Komplex, an dem noch mindestens drei weitere Moleküle beteiligt sind.

2.5.1, Regulation der A20-Expression durch den NF-KB-Signalweg:

Wie bei CYLD wird auch die Expression von A20 transkriptionell durch den NF-KB-Signalweg, nach einer entsprechenden Stimulation, induziert. HE et al. stellten in einer Studie an einer Jurkat-Zelllinie (Leukämiezellen die von menschlichen T-Zellen abstammen) fest, dass diese im unstimulierten Zustand ein sehr geringes A20-Niveau aufwiesen und es ca. zwei Stunden nach einer TNFa-Gabe zu einer Zunahme an A20-Gentranskripten kam. Dies deutet darauf hin, dass A20 als eine Deubiquitinase fungiert, die in einem autoregulatorischem Kreislauf die NF-KB-Aktivität herabsetzt. Hingegen führte die Stimulation in den Zellen, in denen man NEMO ausgeschaltet hatte zu keiner A20-Expression, was ein Beleg dafür ist, dass IKK an der Induktion der Gen-expression durch TNFa involviert ist bzw. ein Mangel an NEMO die TNFa-induzierte A20-Expression inhibiert. Interessanterweise induziert auch IL1 die A20-Expression, obwohl man bisher davon ausgegangen war, dass A20 selbst nicht in dem IL1-Signalweg involviert ist. Darauf aufbauend behandelten WERNER et al. embryonische Mausfibroblasten mit IL1 und setzten diese, sowie eine unbehandelte Mäusefibroblasten einem TNFα-Stimulus aus. Die Unterschiede waren zwar nicht wesentlich, gaben aber einen Hinweis darauf, dass eine IL1-Gabe die Auswirkungen eines darauffolgenden TNFa-Stimulus abschwächt, d.h. dass A20 die Sensitivität für TNFa herabsetzen kann.

Es sei an dieser Stelle daran erinnert, dass Zellen in einem lebenden Organismus zeitnah einer Vielzahl von Stimuli ausgesetzt sind. Neuere Studien konnten nachweisen, dass A20 im IL1-Signalweg an der Deubiquitinierung von TRAF6 und somit auch an dieser Signalkaskade beteiligt ist.