Aufbau und Erprobung eines Messplatzes zur Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauer von NIR- Farbstoffen

Bachelorarbeit von Julia Göpner

Einleitung:

Cyaninfarbstoffe, wie Indocyaningrün, Omocyanin und SIDAG, finden eine große Anwendung als optische Marker in Bereichen der medizinischen Diagnostik. So zum Beispiel in der Ophthalmologie als Kontrastmittel zur Darstellung des Augenhintergrundes. In der Forschung werden ICG wie auch Omocyanin zur Diagnose und Früherkennung von Brusttumoren eingesetzt. Der Farbstoff SIDAG wird ausschließlich in Tierversuchen verwendet. Die Arbeitsgruppe 8.31 ‘Gewebeoptik und molekulare Bildgebung’ der Physikalisch Technischen Bundesanstalt (PTB) beschäftigt sich seit mehreren Jahren mit der fluoreszenzgestützen Laserimpuls-Mammografie. Bei diesem Verfahren wird der fluoreszierende Farbstoff intravenös in die Blutbahn gegeben. Durch Bestrahlung der Brust mit einem gepulsten Laser werden diese Farbstoffe angeregt und die anschließende Fluoreszenzemission gemessen. Wenn der Farbstoff sich vorranging im Karzinom anreichert, so können Bereiche mit erhöhter Fluoreszenz auf bösartige Läsionen hinweisen. Der Vorteil dieser Farbstoffe ist, dass diese bei Wellenlängen um die 750 nm.- 810 nm ihre Absorptionsmaxima aufweisen. Genau in diesem Wellenlängenbereich weist wiederum menschliches Gewebe eine geringe Absorption auf, wodurch hohe Eindringtiefen erreicht werden können. Die Emissionsmaxima der Farbstoffe liegen je nach Farbstoff im Bereich zwischen 780 nm - 830 nm.

Neben den Fluoreszenzintensitäten, welche von der Farbstoffkonzentration wie auch von der Temperatur abhängig sind, kann auch die Fluoreszenzlebensdauer, welche eine wichtige Eigenschaft von Farbstoffen ist, gemessen werden. Diese gibt Informationen über das umliegende Gewebe und ist dabei konzentrationsunabhängig. Sie ist somit nur von den Stoffeigenschaften des Gewebes, in welchem der Farbstoff gelöst ist, abhängig. Dadurch können Fluoreszenzlebensdauermessungen Aussagen über die chemischen Eigenschaften des umliegenden Gewebes geben (pH-Wert, Sauerstoffsättigung, Polarität etc.). Dabei weist die Fluoreszenzlebensdauer eine hohe Empfindlichkeit auf und reduziert so das Signal-Rausch Verhältnis. Ein Vorteil ist auch, dass die Messungen der Fluoreszenzlebensdauer nicht so stark von den Streueffekten beeinflusst werden, wie es bei Messungen von Fluoreszenzintensitäten der Fall ist.

Eine Möglichkeit zur Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauer bietet die zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Messplatz zur Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauern von NIR- Farbstoffen aufgebaut und getestet. Nach dem Aufbau wurden alle zur Messung beitragenden Komponenten hinsichtlich der Zeitauflösung optimiert (Kapitel 4). Mithilfe einer Einzelphotonenzählungseinheit konnte das Fluoreszenzsignal mit hoher Zeitauflösung gemessen und ausgewertet werden. Zum Anpassen des gemessenen Zeitverlaufs an die Theoriekurve wurden mit Hilfe des Programms Matlab exponentielle Fits durchgeführt. Zum Fitten der Messkurven wurde die Impulsantwortfunktion (Response) des Messsystems benötigt. Diese gibt Informationen über den zeitlichen Versatz, der durch den Messaufbau und die damit verbundenen Techniken entsteht. Zur Messung der Response wurde anstatt des Farbstoffs ein streuendes Medium als Probe verwendet. Es wurden unterschiedliche Lösungsmittel dafür verwendet und untereinander verglichen (Kapitel 5). Anschließend wurden Lebensdauermessungen von drei Farbstoffen, gelöst in unterschiedlichen Flüssigkeiten, durchgeführt (Kapitel 6). Diese waren Indocyaningrün, Omocyanin und SIDAG.

Inhaltsverzeichnis:

Textprobe:

Kapitel 2.5, Farbstoffe:

Die in dieser Arbeit verwendeten Farbstoffe sind aus der Gruppe der Cyanine. Diese sind organische Farbstoffe aus der Gruppe der Polymethin-Farbstoffe. Ihnen gleich ist, dass sie aus einer Aneinanderreihung von Methingruppen (=CR_) bestehen, wobei R als Substituent von Farbstoff zu Farbstoff variieren kann [Johannes2000]. Als Farbstoff für die Laserimpuls-Mammografie wird ICG benutzt, da von den Cyaninfarbstoffen bisher nur dieser für die Anwendung am Menschen zugelassen ist.

2.5.1, Indocyaningrün (ICG):

Indocyaningrün ist ein fluoreszierender Farbstoff, der als Diagnostikum in der Medizin verwendet wird. Die Summenformel dieses pulverförmigen Stoffes lautet: C43H47N2NaO6S2. Besonders gut löslich ist ICG, dessen molare Masse 774,99 g/mol beträgt, in Wasser, Methanol und Ethanol. Die Stabilität hängt sowohl von der ICG Konzentration selbst und vom Lösungsmittel ab. Das in dieser Arbeit verwendete ICG stammt von der Firma Pulsion, die zugleich Hersteller und Zulassungsinhaber für dieses Kontrastmittel in Deutschland ist.

Das Absorptionsspektrum wie auch das Emissionsspektrum liegen im Nahinfrarotbereich. Das Maximum der Absorption liegt je nach Lösungmittel zwischen 780 nm und 830 nm. Durch die geringe Stokes’sche Verschiebung muss bei Messungen stark darauf geachtet werden, dass das Anregungslicht gut unterdrückt wird, da das Emissionsspektrum sein Maximum bereits bei ca. 810 nm – 830 nm erreicht. Dieses Maximum ist abhängig von dem Medium, in dem das ICG gelöst ist. So ist das Emissionsmaximum im Blut bei ca. 830 nm zu finden, während es sich im Wasser bei ca. 810 nm befindet.

Durch die Überlappung der beiden Spektren kann es zusätzlich auch zur Reabsorption der Fluoreszenz kommen. Dabei wird ein Fluoreszenzphoton vom ICG selbst wieder absorbiert. Die Quantenausbeute von ICG in Wasser ist mit 0.01 relativ gering. Da das menschliche Gewebe bei einer Wellenlänge von 780 nm eine geringe Absorption und somit eine hohe Eindringtiefe aufweist und ICG in diesem Bereich sein Absorptionsmaximum hat, lässt sich dieses gut im menschlichen Körper detektieren. Das ICG wird dafür intravenös verabreicht und bindet sich in Folge sofort an die im Blut befindlichen Plasmaproteine. Es werden ca. 0,1 mg bis 0,3 mg pro kg Körpergewicht verabreicht.

Anschließend wird das Gewebe mit einem Laser geeigneter Wellenlänge bestrahlt und schließlich das emittierte Fluoreszenzlicht gemessen. Durch die Bindung an Plasmaproteine verbleibt das ICG kurzzeitig im Körper und wird anschließend über die Leber und Gallenwege aus dem Körper ausgeschieden. Die Anwendung von ICG für diagnostische Untersuchungen wird in vielen Bereichen verwendet. Hauptanwendungen sind dabei ophthalmologische Untersuchungen, Überwachung der Leber- bzw. Splanchnikusperfusion (nicht-invasiv) und Messungen zur Gewebeperfusion. Hinzu kommen die an der PTB durchgeführten Anwendungen zur Erkennung rheumatischer Erkrankungen und zur Detektion von Mammakarzinomen.

Da diese Arbeit in der Arbeitsgruppe der Laserimpuls-Mammografie entstand, wird auf das Verfahren der Detektion von malignen Mammakarzinomen näher eingegangen. Dabei verhält es sich so, dass Proteine, an denen nach Injektion das ICG gebunden ist, aus der Blutbahn austreten können, wenn die Durchlässigkeit der Gefäße hinreichend groß ist. Bei gesundem Gewebe ist dies nicht der Fall. Scannt man die Brust mit einem Anregungslaser ab und misst dabei die entstehende Fluoreszenz, so können Bereiche mit erhöhtem Fluoreszenzsignal auf ein Karzinom hinweisen. Diese Methode kann ebenfalls zur Wächterlymphknotendetektion verwendet werden. Dabei wird der sogenannte Wächterlymphknoten, welcher der am nächsten zum Karzinom liegende Lymphknoten ist, detektiert und zur Biopsie entfernt. Dieser wird auf eventuelle Streuung des Tumors untersucht. Ist dies der Fall müssen weitere Lymphknoten entfernt werden.