Anaerobe Ammoniakoxidation von Nitrosomonas eutropha

Dissertation / Doktorarbeit von Ingo Schmidt

Zusammenfassung:

Obligat chemolithoautotrophe Ammoniakoxidanten oxidieren Ammoniak mit Sauerstoff als Oxidationsmittel zu Nitrit, um ihren Bedarf an Energie zu decken. Sie sind in verschiedenen Ökosystemen weit verbreitet, in denen unter oxischen Bedingungen organische Verbindungen mineralisiert und anorganische Stickstoffverbindungen wie Ammonium freigesetzt werden. So konnten Ammoniakoxidanten in oxischen Bereichen von Böden, Gewässern und Abwassersystemen sowie auf Gesteinsoberflächen nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurden diese Organismen allerdings auch in anoxischen Bereichen von Böden und Gewässern gefunden. Da kein anaerober Stoffwechsel der Ammoniakoxidanten bekannt war, wurde vermutet, daß die Organismen passiv in diese Bereiche eingetragen worden waren und dort stoffwechselinaktiv vorlagen. Es war unbekannt, warum unter diesen Bedingungen oftmals eine deutliche Zunahme der Zellzahl nachzuweisen war. In der Folgezeit konnte gezeigt werden, daß Ammoniakoxidanten der Gattung Nitrosomonas (Nitrosomonas eutropha und Nitrosomonas europaea) in der Lage sind, unter anoxischen Bedingungen Acetat, Pyruvat und Wasserstoff als Elektronendonatoren und Nitrit als Elektronenakzeptor zu verwenden. Als Produkt wird neben geringen Mengen von Stickstoffmonoxid (NO) und Distickstoffoxid (N2O) in erster Linie molekularer Stickstoff (N2) freigesetzt. Auf der Basis dieses Stoffwechsels konnte ein Zellwachstum nachgewiesen werden.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmals ein neuer Stoffwechseltyp - die anaerobe Ammoniakoxidation - bei chemolithoautotrophen Ammoniakoxidanten nachgewiesen. Weiterhin wurde eine Methode für die Untersuchung des Ammoniak oxidierenden Systems in zellfreien Extrakten entwickelt.

Unter anoxischen Bedingungen oxidierten Zellen von Nitrosomonas eutropha, Nitrosomonas europaea und Nitrosolobus multiformis Ammoniak mit Stickstoffdioxid bzw. Distickstofftetroxid (NO2/N2O4) als Oxidationsmittel über das Zwischenprodukt Hydroxylamin zu Nitrit. Als weiteres Stoffwechselprodukt konnte Stickstoffmonoxid (NO) nachgewiesen werden. Bis zu 50 % des entstandenen Nitrits wurden von den Organismen zu molekularem Stickstoff denitrifiziert. Außerdem wurden als Zwischenprodukt der Denitrifikation geringe Mengen Distickstoffoxid (N2O) nachgewiesen. Bei Nitrosomonas eutropha war die anaerobe Ammoniakoxidation mit einer ATP- und NADH-Produktion sowie einem Zellwachstum verbunden. Die höchsten spezifischen anaeroben Ammoniakoxidationsaktivitäten wurden bei Nitrosomonas eutropha mit 129,4 µmol - g Protein-1 - h-1 in einer Helium-Atmosphäre mit 25 ppm NO2 ermittelt. Die Ammoniakoxidationsrate lag damit ca. um den Faktor 10 niedriger als unter oxischen Bedingungen. Die Zugabe von Stickstoffmonoxid wirkte sich stark hemmend auf die anaerobe Ammoniakoxidationsaktivität aus. Diese inhibitorische Wirkung konnte durch die Zugabe von 2,3-Dimercapto-1-Propansulfonat (DMPS) einer NO komplexierenden Verbindung deutlich vermindert werden. Im Gegensatz dazu führte NO unter oxischen Bedingungen nur zu einer geringen Hemmung der Ammoniakoxidationsaktivität. Allerdings wurde in Gegenwart von Sauerstoff die Ammoniakoxidation durch DMPS zeitweise vollständig gehemmt. Durch die Zugabe von NO oder NO2 konnte die Zeitdauer dieser Inhibition erheblich verkürzt werden.

Auf die aerobe und anaerobe Ammoniakoxidation von Nitrosomonas eutropha hatte NO2 weiterhin folgende Effekte:

In einer NO2-haltigen oxischen Atmosphäre angezogene Zellen wiesen in den ersten 30 Stunden eine signifikant höhere anaerobe Ammoniakoxidationsaktivität auf als Zellen, die in einer NO2-freien Atmosphäre angezogen worden waren.

Ein fünfmaliger Wechsel zwischen anoxischen und oxischen Bedingungen innerhalb von fünf Tagen führte zu einer starken Abnahme der Ammoniakoxidationsaktivität. Demgegenüber blieben in Gegenwart von 25 ppm NO2 die Ammoniakoxidationsaktivitäten über diesen Zeitraum nahezu unverändert.

Neben Ammoniak konnte unter anoxischen Bedingungen auch Wasserstoff als alleiniger Elektronendonator und Nitrit als Elektronenakzeptor genutzt werden. Bei der Umstellung auf einen Ammoniak oxidierenden Stoffwechsel war die Überlebensrate der Organismen deutlich größer, wenn die Gasatmosphäre während der Umstellung mit NO2 angereichert worden war.

Erstmals konnte nach Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation in zellfreien Fraktionen von Nitrosomonas eutropha eine anaerobe Ammoniakoxidationsaktivität nachgewiesen werden. Während der Ammoniakoxidation wurde ein NO2-Verbrauch bei gleichzeitiger NO-Produktion beobachtet. Durch spezifische Hemmung der Hydroxylaminoxidation mit Hydrazin konnte gezeigt werden, daß der NO2-Verbrauch und die NO-Produktion direkt an die Oxidation von Ammoniak zu Hydroxylamin gekoppelt waren. Es wurde ein Verhältnis von 1:1 zwischen der Ammoniakoxidationsrate und der Hydroxylaminproduktionsrate sowie zwischen der NO2-Verbrauchsrate und der NO-Produktionsrate ermittelt. Das Verhältnis zwischen der Ammoniakoxidationsrate und der NO2-Verbrauchsrate bzw. der NO-Produktionsrate betrug 1:2. In zellfreien Extrakten konnte auch nach der Absenkung der Temperatur von 25 oC auf 4 oC eine anaerobe Ammoniakoxidation nachgewiesen werden. Da bei dieser Temperatur Stickstoffdioxid nahezu vollständig als Dimer (N2O4) vorliegt, ist zu vermuten, daß N2O4 das eigentliche Oxidationsmittel bei der anaeroben Ammoniakoxidation ist.

Sauerstoff wirkte stark hemmend auf die Ammoniakoxidationsaktivität zellfreier Systeme. Unter dem Einfluß von NO2 konnte allerdings auch unter oxischen Bedingungen eine geringe Ammoniakoxidation nachgewiesen werden.

In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, daß Nitrosomonas eutropha unter anoxischen Bedingungen Ammoniak in Gegenwart von NO2/N2O4 oxidiert und auf der Basis dieses Stoffwechsels wachsen kann. Auch andere chemolithoautotrophe Ammoniakoxidanten wie Nitrosomonas europaea und Nitrosolobus multiformis waren in der Lage, unter diesen Bedingungen Ammoniak zu oxidieren. Des weiteren wurde eine Methode zur Untersuchung des Ammoniak oxidierenden Systems chemolithoautotropher Ammoniakoxidanten in zellfreien Extrakten entwickelt.

Inhaltsverzeichnis: